[发明专利]一种外泌体蛋白检测方法

说明书

本发明涉及一种外泌体蛋白检测方法，具体涉及一种磁分离与多色荧光微球的流式细胞术相结合的外泌体提取及蛋白检测的方法。本发明属于生物医药领域。采用大比表面积的纳米级磁性微球增加抗体结合位点和外泌体捕获效率。以多色荧光微球标记不同的外泌体蛋白，结合流式细胞术，快速灵敏对不同外泌体蛋白进行检测。

技术领域

本发明涉及一种外泌体蛋白检测方法，基于磁性纳米颗粒和荧光微球标记流式细胞术的外泌体分离和蛋白检测的方法和应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

外泌体是一种由活细胞分泌，直径约为30-150 nm，来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡结构，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等体液中。外泌体在细胞之间充当重要的沟通介质，进而影响细胞而至组织的生理活动。外泌体的功能包括：细胞增值与凋亡调控，转移与侵袭，血管生成，免疫应答，细胞分化，代谢调控，微生物组调控，病毒感染。随着对外泌功能的基础研究不断深入，外泌体在液体活检、精准医学与再生医学的应用潜力被广泛认可。

目前，市面上已有的关于外泌体提取的产品原理有：利用不同孔径的膜来分离细胞外囊泡；利用聚合物降低来析出沉淀外泌体；利用尺寸排阻色谱的进行分离；基于抗原抗体或者其他类似的反应特异性的免疫亲和捕获分离出外泌体。而对外泌体蛋白标志物的检测主要通过western blot、免疫组化等等方法进行，实验费时繁琐，因此急需一种简便、快速的外泌体分离及蛋白检测方法。

发明内容

针对现有需求，本发明目的在于提供一种外泌体蛋白检测方法，基于磁性纳米颗粒和荧光微球标记流式细胞术的外泌体分离提取和蛋白检测的方法。

本发明目的方法通过以下方案实现：一种外泌体蛋白检测方法，一种磁分离与多色荧光微球的流式细胞术相结合的外泌体提取及蛋白检测的方法，包括以下步骤：

1.磁珠与抗体连接：称取100 mg 纳米磁性颗粒充分溶解于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS，20 mM，pH 6）；上述溶液中加入0.5 mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，20 mM）与0.5 mL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，40 mM），充分混合均匀，25℃活化30 min；活化后的磁珠磁吸除去上清液，PBS彻底清洗3次，加入1 mL PBS（10 mM，pH 7）；取10~100 μL 抗体（1 mg/mL）加入活化后的磁珠，混合均匀后25℃反应过夜；反应结束后，磁吸除去上清液，采用含0.1% 吐温-20的PBS（10 mM，pH 7）彻底清洗2次后，加入0.1% BSA、0.01%酪蛋白，0.1% 吐温-20 的PBS（10 mM，pH 7），25℃反应30 min后磁吸去除上清，彻底清洗后，加入1 mL 0.1% BSA、0.1% 吐温-20 的PBS（10 mM，pH 7），4℃保存，记为抗体标记磁珠。

2.荧光微球与抗体连接：称取100 mg荧光微球充分溶解于1 mL PBS（20 mM，pH6）；上述溶液中加入0.5 mL 20 mM EDC与0.5 mL 40 mM，充分混合均匀，25℃活化30 min；活化后的荧光微球离心去上清液，PBS彻底清洗3次，加入1 mL PBS（10 mM，pH 7）；取10~100μL 抗体（1 mg/mL）加入活化后的荧光微球，混合均匀后25℃反应过夜；反应结束后，离心除去上清液，采用含0.1% 吐温-20的PBS（10 mM，pH7）彻底清洗2次后，加入0.1% BSA、0.01%酪蛋白，0.1% 吐温-20 的PBS（10 mM，pH7），25℃反应30 min后离心去除上清，彻底清洗后，加入1 mL 0.1% BSA、0.1% 吐温-20 的PBS（10 mM，pH7），4℃保存，记为荧光微球。