[发明专利]一种单细胞多组学文库及其构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单细胞多组学文库及其构建方法。本发明将Tn5转座子一端的测序接头改造为特定的连接序列，用于连接barcode；可以完成单细胞的转录组和染色质开放区域同时建库，采用细胞组合标签技术，不需要额外的仪器设备，建库成本相比于10xGenomics公司的方案大幅下降。本发明所采用的文库结构适配现有二代测序通用的PE150测序，无需自定义测序程序，测序成本相比于SHARE‑seq可大幅度降低。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单细胞多组学文库及其构建方法。

背景技术

单细胞测序目前主要有两种方法：一种是采用微流控、微孔板等方式空间上进行单细胞隔离，另一种是基于细胞标签技术对通过组合标签标记来区分单细胞。已商业化的单细胞测序技术大多基于空间隔离的方式，例如10x Genomics公司的单细胞建库方案，其优势在于操作简单，研究人员只需要完成单细胞悬液制备工作即可接入到10x的建库流程中，缺点在于细胞通量不够高，单次建库仅能检测10000个细胞左右，并且价格昂贵。

组合细胞标签技术不需要在空间上进行单细胞分离，而是通过多次随机的barcode标记为每个细胞带上独特的组合标签。目前利用组合标签技术开发的单细胞测序技术有sci-RNA-seq，sci-CAR，sci-ATAC-seq，SPLiT-seq，Paired-seq，SHARE-seq等。以SPLiT-seq为例，该方法通过将逆转录后的细胞分散到96孔板中，每个孔中都有独特的barcode连接到cDNA上，然后收集细胞，以相同的方式进行第二轮和第三轮barcode连接，这样每个细胞就有了一个独特的组合barcode用于与其他细胞进行区分。

sci-CAR最早通过组合标签技术完成了单细胞多组学的建库，即能同时检测单个细胞中的mRNA和染色质开发区域，但sci-CAR采用的组合标签数不多，因此检测的细胞通量较低。

Paired-seq是加州大学任兵团队开发的单细胞多组学技术，该技术通过4轮的barcode标记，可将检测通量提高至10^6，该技术首先利用带有barcode和酶切位点的Tn5转座酶对细胞核进行转座，然后进行逆转录反应，在cDNA和Tn5标记DNA上同时连接三轮barcode，文库扩增后通过酶切对文库进行分离、测序(见图1)。

SHARE-seq是麻省理工学院Jason D.Buenrostro和AvivRegev团队开发的单细胞多组学测序技术，该技术相比于Paired-seq改变了Tn5转座条件和文库分离条件，并且可以检测细胞质中的mRNA，该技术首先利用NexteraTn5转座酶进行转座，然后利用带有biotin修饰的引物进行逆转录，经过三轮barcode连接后进行解交联，用链霉亲和素磁珠分离文库、测序(见图2)。

Paired-seq不能检测细胞质中的mRNA，同时需要构建8种Tn5转座酶，技术门槛较高。SHARE-seq需构建两种Tn5转座酶，可以检测细胞质中的mRNA，数据质量相比Paired-seq更高，但SHARE-seq的文库结构不适用于现有测序公司通用的PE150测序方法，需自定义测序程序，而国内测序公司的测序报价十分昂贵，因此SHARE-seq文库测序成本非常高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种单细胞多组学文库及其构建方法。该方法重新构建了Tn5插入序列用于barcode连接，文库结构与SPLiT-seq和Paired-seq类似，适用于PE150测序，测序成本相比于SHARE-seq大幅降低。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种Tn5转座酶复合物，标记为Tn5-2，其包括Tn5转座酶和第一组装序列；

所述第一组装序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。