[发明专利]一种单细胞多组学文库及其构建方法在审
申请号: | 202211229780.8 | 申请日: | 2022-10-08 |
公开(公告)号: | CN115537408A | 公开(公告)日: | 2022-12-30 |
发明(设计)人: | 黄佳良;朱明;杨屹顶 | 申请(专利权)人: | 厦门大学 |
主分类号: | C12N9/12 | 分类号: | C12N9/12;C12Q1/6806;C40B40/06;C40B50/06 |
代理公司: | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人: | 赵青朵 |
地址: | 361005 *** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 单细胞 多组学 文库 及其 构建 方法 | ||
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种单细胞多组学文库及其构建方法。本发明将Tn5转座子一端的测序接头改造为特定的连接序列,用于连接barcode;可以完成单细胞的转录组和染色质开放区域同时建库,采用细胞组合标签技术,不需要额外的仪器设备,建库成本相比于10xGenomics公司的方案大幅下降。本发明所采用的文库结构适配现有二代测序通用的PE150测序,无需自定义测序程序,测序成本相比于SHARE‑seq可大幅度降低。
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种单细胞多组学文库及其构建方法。
背景技术
单细胞测序目前主要有两种方法:一种是采用微流控、微孔板等方式空间上进行单细胞隔离,另一种是基于细胞标签技术对通过组合标签标记来区分单细胞。已商业化的单细胞测序技术大多基于空间隔离的方式,例如10x Genomics公司的单细胞建库方案,其优势在于操作简单,研究人员只需要完成单细胞悬液制备工作即可接入到10x的建库流程中,缺点在于细胞通量不够高,单次建库仅能检测10000个细胞左右,并且价格昂贵。
组合细胞标签技术不需要在空间上进行单细胞分离,而是通过多次随机的barcode标记为每个细胞带上独特的组合标签。目前利用组合标签技术开发的单细胞测序技术有sci-RNA-seq,sci-CAR,sci-ATAC-seq,SPLiT-seq,Paired-seq,SHARE-seq等。以SPLiT-seq为例,该方法通过将逆转录后的细胞分散到96孔板中,每个孔中都有独特的barcode连接到cDNA上,然后收集细胞,以相同的方式进行第二轮和第三轮barcode连接,这样每个细胞就有了一个独特的组合barcode用于与其他细胞进行区分。
sci-CAR最早通过组合标签技术完成了单细胞多组学的建库,即能同时检测单个细胞中的mRNA和染色质开发区域,但sci-CAR采用的组合标签数不多,因此检测的细胞通量较低。
Paired-seq是加州大学任兵团队开发的单细胞多组学技术,该技术通过4轮的barcode标记,可将检测通量提高至10^6,该技术首先利用带有barcode和酶切位点的Tn5转座酶对细胞核进行转座,然后进行逆转录反应,在cDNA和Tn5标记DNA上同时连接三轮barcode,文库扩增后通过酶切对文库进行分离、测序(见图1)。
SHARE-seq是麻省理工学院Jason D.Buenrostro和AvivRegev团队开发的单细胞多组学测序技术,该技术相比于Paired-seq改变了Tn5转座条件和文库分离条件,并且可以检测细胞质中的mRNA,该技术首先利用NexteraTn5转座酶进行转座,然后利用带有biotin修饰的引物进行逆转录,经过三轮barcode连接后进行解交联,用链霉亲和素磁珠分离文库、测序(见图2)。
Paired-seq不能检测细胞质中的mRNA,同时需要构建8种Tn5转座酶,技术门槛较高。SHARE-seq需构建两种Tn5转座酶,可以检测细胞质中的mRNA,数据质量相比Paired-seq更高,但SHARE-seq的文库结构不适用于现有测序公司通用的PE150测序方法,需自定义测序程序,而国内测序公司的测序报价十分昂贵,因此SHARE-seq文库测序成本非常高。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种单细胞多组学文库及其构建方法。该方法重新构建了Tn5插入序列用于barcode连接,文库结构与SPLiT-seq和Paired-seq类似,适用于PE150测序,测序成本相比于SHARE-seq大幅降低。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
一种Tn5转座酶复合物,标记为Tn5-2,其包括Tn5转座酶和第一组装序列;
所述第一组装序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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