[发明专利]一种体外合成群体感应信号分子AI-2的方法

说明书

本发明公开了一种体外合成群体感应信号分子AI‑2的方法，属于群体感应信号分子的合成技术领域。根据奇球菌Y35基因组中AI‑2合成关键基因pfs和luxS设计引物，以菌株Y35基因组DNA为模板对基因pfs和luxS进行扩增，扩增产物经过酶切纯化后与酶切后的质粒pET28a连接，构建重组质粒pET28a‑pfs和pET28a‑luxS，并在表达菌株E.coli BL21(DE3)进行异源表达，进一步对诱导条件进行响应面优化，提高蛋白的产量，降低AI‑2体外合成的成本，并对AI‑2的产量进行测定。本方法能够提高AI‑2的产量，为群体感应信号分子AI‑2的合成以及后续相关研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于群体感应信号分子的合成技术领域，具体涉及一种体外合成群体感应信号分子AI-2的方法。

背景技术

群体感应（Quorum sensing, QS）是普遍分布在微生物界的一种重要的细胞−细胞之间进行沟通的机制，是指细菌依赖于种群密度变化从而调节基因表达的过程。有研究结果表明，当细菌开始慢慢地分裂生长，其密度会随之逐渐增加，在这个过程中大多数细菌会分泌一种化学信号分子，其被称为自诱导物（Autoinducer, AI）。当群体密度升高时，细胞外AI的浓度也会随之波动，而且这种波动呈正相关。细菌通过其自身所特有的能力感知胞外AI的浓度，从而在一定程度上响应其群体的密度。当AI的浓度达到所指定的水平时，会使细菌中的一些相关基因开始表达，从而调控诸多生物行为，如发光、生物膜的发育与形成、毒力因子的产生等。不同细菌的QS系统也有区别，信号分子类型也会随细菌的差异而有所不同，目前该系统大致可分成三种类型：（1）革兰氏阴性细菌中由不同长度酰基侧链的高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactone, AHLs）介导的AHL型信息系统；（2）革兰氏阳性细菌中寡肽（Autoinducing peptides, AIPs）介导的信息系统；（3）在革兰氏阳性、阴性菌都存在，可用于细菌种间交流的LuxS/AI-2型信息系统。

AI-2信号分子在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中都被检测到，所以将AI-2视为种间通用信号分子，它起着至关重要的信号传递与交流的作用。AI-2是由几种相似的小分子所构成的混合物，但是这些小分子构象并不相同。另外，相关研究人员在对AI-2的晶体结构进行X-射线衍射分析发现，在菌体中AI-2存在两种活性形式即：硼酸化的S-THMF-borate和非硼酸化的R-THMF，并且发现它们之间的差异跟它们所处的环境有关。AI-2在细菌细胞内的合成途径主要由三个阶段的酶促反应组成。第一步，S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine, SAM）依赖其相关转移酶的催化作用，转化为一种中间产物S-腺苷同型半胱氨酸（S-Adenosylhomocysteine, SAH），该产物带有毒性；第二步，SAH由S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（Pfs）催化水解，该步骤产生两种中间产物，即S-核糖同型半胱氨酸（S-Ribosylhomocysteine, SRH）和腺嘌呤，该产物没有毒性；第三步，SRH在S-核糖同型半胱氨酸酶（LuxS）的催化下生成所需要的前体物质，这种物质是4,5-二羟基-2,3-戊二酮（DPD）以及高半胱氨酸，其中DPD脱水环化形成呋喃基硼酸二酯类分子（AI-2）。

奇球菌Y35是高产AI-2菌株，本发明利用奇球菌Y35基因组克隆表达出AI-2合成途径中的关键蛋白Pfs和LuxS，并体外催化SAH合成AI-2，从而为大量高效合成群体感应信号分子AI-2提供必要条件，目前尚没有该方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种体外合成群体感应信号分子AI-2的方法，该方法利用奇球菌Y35基因组克隆表达蛋白Pfs和LuxS，优化蛋白产量，降低生成成本，并通过体外催化SAH实现AI-2的体外高效合成。