[发明专利]提高重组蛋白质可溶性表达的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及提高重组蛋白质可溶性表达的方法。本发明构建了T7RNA聚合酶启动子突变菌株，可提高异源蛋白表达的可溶性。结果表明T7RNA聚合酶启动子(lacUV5)的‑35区一个碱基T缺失可降低T7RNA聚合酶转录水平，提高异源蛋白表达的可溶性。在相同实验条件下，本发明构建的突变菌株与BL21(DE3)、BL21‑C41(DE3)及BL21‑Plac1G(DE3)比较，异源蛋白质可溶部分占比得到了显著提高。且此方法能够比较有效且稳定的从根本上解决大肠体系蛋白表达速度过快造成不可溶表达的问题，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及提高重组蛋白质可溶性表达的方法。

背景技术

目前应用于工业重组表达外源蛋白质的系统中，大肠杆菌表达系统是应用最广泛的系统之一。大肠杆菌表达系统易于培养操作，周期短、大规模生产成本低，且表达水平高。T7大肠杆菌表达系统是以T7启动子、T7RNA聚合酶等T7噬菌体转录体系的元件为核心构建的表达系统。T7RNA聚合酶是一种高活性的RNA聚合酶，mRNA的合成速度比大肠杆菌内的RNA聚合酶快5倍，并且某些不能被大肠杆菌自身RNA聚合酶转录的序列也可以转录，因此，T7大肠杆菌表达系统外源蛋白表达水平很高，受到工业界的青睐。但是，高速的转录速度，也导致目标蛋白表达时来不及正确折叠，进而形成包涵体。包涵体是蛋白质在宿主细胞内形成不可溶性的沉淀，不能形成正确的空间结构。包涵体蛋白质不具备它应有的生物活性，不可被应用在工艺反应过程中。所以，如何让大肠杆菌表达体系高比例可溶性表达目标蛋白质，少形成包涵体，是蛋白质大规模发酵表达产业中的重要难题。

目前已经有很多公开的技术方法被证明能有效改善可溶性表达。其中市场上的C41(DE3)感受态细胞产品，通过毒性蛋白在BL21(DE3)内过表达筛选实验得到的基因突变菌株，该菌株的基因突变降低了T7 RNA聚合酶的酶活性，下调毒性蛋白的表达量使细胞存活。公开发表的文献中将E.coli BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶启动子(lacUV5)改为Plac-1G，达到降低T7聚合酶表达的效果。但针对于不同性质的非可溶蛋白的可溶性及活力等的影响因素是多样的，如氨基酸的组成及排列方式，其形成的二级、三级、四级结构及蛋白表达及发挥活力环境等等，加之T7 RNA聚合酶启动子不同碱基突变引起的作用效果是很难预测的，因此不断开发新的提高蛋白可溶性的系统，有助于不同来源蛋白的表达与科学研究。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提高重组蛋白质可溶性表达的方法。

本发明提供了lacUV5启动子变体，其-35区缺失一个T碱基。

本发明中，所述lacUV5启动子野生型，包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。所述的lacUV5启动子变体是通过构建lacUV5启动子野生型突变体库并经有效性筛选获得。一些具体实施例中，lacUV5启动子变体的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。经实验表明，本发明所述的lacUV5启动子变体可降低T7RNA聚合酶的表达速率，从而提高异源蛋白表达的溶解性。

本发明提供了基因表达盒，其包括本发明所述的lacUV5启动子变体和结构基因。所述结构基因来源包括植物、动物、真菌、细菌、病毒、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体或显微藻类。

本发明中，所述结构基因包括编码蛋白质的基因、编码酶的基因、编码寡肽的基因、编码多肽的基因、编码RNA的基因。本发明所述结构基因编码各种功能蛋白、寡肽、多肽或RNA。本发明中，所述结构基因成簇排列或单独存在，其中，成簇排列的结构基因中的多个结构基因受单一启动子共同控制。进一步的，在一些具体实施例中，本发明所述结构基因为位于lacUV5启动子变体下游的T7RNA聚合酶结构基因。在另一些具体的实施例中，本发明所述的lacUV5启动子变体可作为其他结构基因的启动子用于启动基因的转录。

本发明提供了质粒载体，其包括：

载体骨架和本发明所述的lacUV5启动子变体；