[发明专利]一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因、厌氧硫酸酯酶成熟酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种厌氧硫酸酯酶成熟酶基因，其特征在于，所述厌氧硫酸酯酶成熟酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因在修饰硫酸酯酶中的应用。

3.一种由权利要求1所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因编码的厌氧硫酸酯酶成熟酶，其特征在于，所述厌氧硫酸酯酶成熟酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求3所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶在修饰硫酸酯酶中的应用。

5.一种权利要求3所述厌氧硫酸酯酶成熟酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的厌氧硫酸酯酶成熟酶基因插入到表达载体中，得到重组表达载体；

2)将所述步骤1)得到的重组表达载体转化到大肠杆菌中进行发酵培养，得到发酵液；

3)将所述步骤2)得到的发酵液在7000g、4℃下离心10min，收集菌体，将所述菌体经细胞裂解缓冲液裂解在13000g、4℃下离心20min，收集沉淀；

4)将所述步骤3)得到的沉淀经包涵体溶解液重悬在13000g、4℃下离心20min，得到上清液，将所述上清液与稀释复性液混合，得到复性蛋白溶液；

5)将所述步骤4)得到的复性蛋白溶液经镍柱纯化，得到厌氧硫酸酯酶成熟酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)表达载体包括pET-28a，所述表达载体经过BamHI和HindIII限制性内切酶酶切。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)发酵培养使用的培养基为含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基；

所述发酵培养的条件包括：温度为37℃，200rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为100μmol/L，16℃，160rpm诱导20h。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)细胞裂解缓冲液包括：50mmol/LTris-base、150mmol/LKCl、体积百分含量为10％甘油、1mmol/L DTT，pH值为7.5。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)包涵体溶解液包括：8mol/L尿素、1mol/LKCl、10mmol/LTris-base，pH值为7.5。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)稀释复性液包括：50mmol/LTris-base、1mol/LNaCl、2mol/L尿素、100mmol/L甘氨酸、1mmol/L还原型谷胱甘肽、1mmol/L EDTA，pH值为7.5。