[发明专利]一种无血清高效培养人NK细胞的方法

权利要求书

1.一种高效培养人NK细胞的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括激活培养基和扩增培养基；

所述激活培养基为含有FB23、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、PMA、PHA的H3无血清培养基；

所述扩增培养基为含有IL-2的H3无血清培养基；

所述激活培养基中各组分的浓度分别为FB23 2 ng/mL，IL-2 20 ng/mL，IL-7 2 ng/mL，IL-12 2 ng/mL，IL-15 50 ng/mL，IL-18 2 ng/mL，IL-21 2 ng/mL，IFN-γ 2 ng/mL，PMA 1 μg/mL，PHA 15 ng/mL；

所述扩增培养基中IL-2的浓度为60 ng/mL。

2.一种无血清高效培养人NK细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：

(1) Day -1，使用包被配方包被抗体孵育培养皿或者培养瓶，4℃条件下包被12 h，得到经包被的培养皿或者培养瓶；

(2) Day 0，将外周血进行分离，得到PBMC细胞；

(3) Day 1- Day 5，采用权利要求1中所述的激活培养基对步骤(2)中得到PBMC细胞在步骤(1)中得到的经包被的培养皿或者培养瓶中进行培养，培养条件为37℃、5% CO₂，得到激活后的PBMC细胞；

(4) Day 6- Day 13，采用权利要求1中所述的扩增培养基对步骤(3)中得到的激活后的PBMC细胞进行培养，培养条件为37℃、5% CO₂；

(5) Day 14- Day 16，收获NK细胞；

步骤(1)中所述的包被配方为：CD3单抗、CD16单抗、CD137单抗、CD52单抗、PD-1单抗和Her-2单抗；

步骤(1)中所述的包被配方中各组分的浓度分别为：CD3单抗 0.75 mg/mL，CD16单抗0.2 mg/mL，CD137单抗 0.05 mg/mL，CD52单抗 0.02 mg/mL，PD-1单抗 0.05 mg/mL，Her-2单抗 0.05 mg/mL。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述PBMC细胞的浓度为1.5×10⁶细胞/mL，培养72 h后，加入同等体积的激活培养基，第120 h，检测PBMC细胞数量，加入所述激活培养基调整PBMC细胞密度为1×10⁶细胞/mL。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中在Day 5时，调整所述PBMC细胞的浓度为1×10⁶细胞/mL，之后每48 h监测PBMC细胞数，如果PBMC细胞数大于2.5×10⁶细胞/mL，则加入所述扩增培养基调整PBMC细胞密度至1×10⁶细胞/mL。