[发明专利]一种无血清高效培养人NK细胞的方法

说明书

本发明公开了一种无血清高效培养人NK细胞的方法，所述方法无外源血清无自体血清使用，只使用细胞因子和化合物，能够高效激活扩增NK细胞，适合规模化细胞制剂的生产和临床应用，此外，所述方法培养过程中不依赖于饲养细胞，提高了使用安全性，避免了回输后由于体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响，临床应用前景广阔。

技术领域

本发明属于免疫细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种无血清高效培养人NK细胞的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统中发挥其主要的抗肿瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来，NK细胞因其细胞杀伤活性高、起效快、不受MHC限制等优点，相对于αβT细胞、γδT细胞和CIK等其它用于免疫治疗的细胞，NK细胞受到了更广泛的关注和临床应用。NK细胞对于机体防御和抗肿瘤至关重要，但肿瘤病人体内的NK细胞通常是功能受损的，因此，通过外源输入功能正常或经过基因改造的功能加强的NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤，即NK细胞过继治疗，是目前癌症治疗的前沿和热点。此外，NK细胞治疗对病毒或细菌感染、免疫调节等相关疾病以及抗衰老也有一定的疗效。

但是NK细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞的10％-15％，在脐带血中NK的含量更低，只有5％左右，正常人体外周血和脐带血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。然而，目前用来培养NK细胞的培养基，多为需在体外扩增阶段，不断添加市售胎牛血清、人AB血清、或患者的自体血清(外周血经淋巴细胞分离液分离出的血浆)的细胞培养基，尚无法实现“完全”无血清培养。其中，使用含胎牛血清的培养基在培养细胞时存在诸多安全问题，胎牛血清的成分复杂，诸多生物因子无法明确检测，培养基的可重复性低，影响实验的准确性，此外，在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中明确规定，严禁细胞制品中残留动物血清蛋白，增加临床风险；使用含人AB血清的培养基存在伦理及血源安全性问题，在2009年4月29日发布的国家有关免疫细胞制备指导守则中同样明确规定，禁止添加同种但异体血清，如人AB血清；使用含患者自体血清的培养基存在如下问题：自体血清收集量有限，部分患者接受过化学药物治疗，自体血清受到影响，从而无法使细胞大量增殖。

因此，如何克服现有技术存在的上述不足，开发出一种新的能够高效激活扩增NK细胞、无外源血清无自体血清使用、安全有效的人NK细胞的培养方法是目前本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种无血清高效培养人NK细胞的方法，所述方法无外源血清无自体血清使用，只使用细胞因子和化合物，能够高效激活扩增NK细胞，采用本发明提供的上述方法培养扩增得到的NK细胞数量多，扩增倍数高达800-1100倍，适用于临床大规模培养，此外，所述方法培养过程中不依赖于饲养细胞，提高了使用安全性，不但可用于自体NK细胞回输，也可以用于同种异体NK细胞的回输。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种高效培养人NK细胞的无血清培养基。

进一步，所述无血清培养基包括激活培养基和扩增培养基；

所述激活培养基为含有FB23、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-γ、PMA、PHA的H3无血清培养基；

所述扩增培养基为含有IL-2的H3无血清培养基。