[发明专利]一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法

说明书

本发明提供了一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法。本发明使用自主研发的酶解方案提升了拟南芥叶片的原生质体得率，通过组织表面清洗、样本剪碎、酶解消化、筛网过滤、去杂洗涤、细胞重悬，使得原生质体的质量较好(活性高，数量多，杂质少)。本发明在原生质体得率上与减少叶绿体的占比上有了明显的提高。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及拟南芥叶片样本解离方法，具体涉及一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法。

背景技术

多细胞生物的组织和器官由大量高度特化的不同细胞构成，每一种细胞类型都有特定的表型和功能。这些特殊的细胞类型是由未分化的祖细胞通过干细胞基因组的表观遗传重编程产生，建立起每个细胞独特的转录特征。了解细胞分化的机制对于理解多细胞生物的生长发育、疾病发生等至关重要，但目前我们对整个生物体中细胞分化、发育的机制了解仍然相当有限，很大程度上是因为从组织中纯化单个细胞类型以进行转录和表观分析的技术难度较高。

以往植物转录组学研究通常是将植物整个器官或组织均质化后测序，因此每个细胞对转录丰度的贡献变得不可识别。这种方法虽然有助于在器官或组织水平上解决许多生物学问题，但是无法了解发生在罕见细胞类型或单个细胞中的转录过程。采用单细胞测序技术，是研究植物单细胞水平转录信息的有效技术手段。不过由于植物细胞周围的细胞壁聚合物和细胞大小的巨大差异，在植物中进行单细胞转录组测序明显比在动物中更具挑战性。植物组织样本较小，解离出1×10⁶数量的单细胞相对困难。文献报道的酶解方式多为纤维素酶过夜解离，该方法耗时长且对原生质体的损伤大，易产生大量的碎片，且过长的酶解时间导致细胞内的转录水平发生变化，不能反映原始样本中细胞真实的转录情况。因此解离出高质量的单细胞悬液尚有较大难度。

发明内容

为了克服现有技术存在的问题，本发明在进行了大量的深入研究后，提供了一种拟南芥叶片样本组织解离液及解离方法。本发明提供的方法包括组织表面清洗、样本剪碎、酶解消化、筛网过滤、去杂洗涤、细胞重悬，本发明通过对叶片进行清洗降低解离过程中杂菌的污染，采用自主研发的组织解离液提高解离效率。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种拟南芥叶片样本组织解离液，所述组织解离液是在8％-10％(W/V)甘露醇溶液中添加1％-3％(W/V)纤维素酶、1％-3％(W/V)果胶酶。

其中，W/V(g/mL)表示质量体积浓度。“8％-10％甘露醇溶液”是指甘露醇在水溶液中的质量体积浓度为8％-10％，“添加1％-3％纤维素酶”是指添加的纤维素酶在8％-10％甘露醇溶液中的质量体积浓度为1％-3％，同样“添加1％-3％果胶酶”是指添加的果胶酶在8％-10％甘露醇溶液中的质量体积浓度为1％-3％。

优选地，所述组织解离液是添加有2％纤维素酶、2％果胶酶的8％甘露醇溶液。

本发明还提供了一种拟南芥叶片样本的解离方法，包括：

(1)表面清洗：将拟南芥叶片样本用甘露醇溶液进行表面清洗；

(2)样本剪碎：将步骤(1)清洗后的叶片置于无菌培养皿中，加入甘露醇溶液浸没过叶片、将叶片切成细条状；

(3)酶解消化：将步骤(2)得到的叶片细条转移至组织解离液中酶解得到原生质体，所述组织解离液是添加有1％-3％纤维素酶、1％-3％果胶酶的8％-10％甘露醇溶液；

(4)筛网过滤：将步骤(3)消化后的悬液置于碎冰上，然后筛网过滤、离心富集、弃消化液；

(5)去杂洗涤：向步骤(4)得到的原生质体沉淀中加入甘露醇溶液离心洗涤；

(6)细胞重悬：向步骤(5)离心后的细胞沉淀中加入甘露醇溶液进行重悬。