[发明专利]一种可视化恒温核酸扩增快速检测猫杯状病毒试剂盒

权利要求书

1.一种可视化恒温核酸扩增快速检测猫杯状病毒试剂盒，包括生物样本快速释放剂、高特异性的恒温扩增引物和胶体金检测层析试纸条,其特征在于：所述生物样本快速释放剂包括A液和B液，所述A液包括氢氧化钾和TritonX-100，所述B液包括Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、氯化镁、二甲亚砜和甘油，所述A液作为猫杯状病毒样本的核酸释放剂，所述B液作为核酸稳定剂，所述A液中氢氧化钾为10～1000mmol/L和TritonX-100为0.005～0.5g/L，所述B液中Tris-HCl为10～1000mmol/L、氯化钾为0.005～0.5mol/L、硫酸铵为0.01～1.0mol/L、氯化镁为0.1～10mmol/L、二甲亚砜为0.01～10g/L和甘油为0.01～10g/L，pH值为7.8～9.0。

2.根据权利要求1所述的可视化恒温核酸扩增快速检测猫杯状病毒试剂盒，其特征在于：其操作方法步骤如下:

S1:生物样本快速释放剂的实现过程；

S2:通过猫杯状病毒恒温核酸扩增特异性放大获得含标签的扩增产物；

S3:通过层析试纸条区分样本阴阳性。

3.根据权利要求2所述的可视化恒温核酸扩增快速检测猫杯状病毒试剂盒，其特征在于：所述S1中的A液、B液以及猫杯状病毒样本分别为200μL、50μL、20μL，且三者混合顺序为，首先A液与猫全血样本混合，混合方式为静置0～2分钟自然扩散，或移液器吹打获得裂解物，然后B液再与裂解物混合，混合方式为自然扩散，进而获得样本中的总核酸，阳性样本则含有猫杯状病毒核酸，而阴性样本则无。

4.根据权利要求2所述的可视化恒温核酸扩增快速检测猫杯状病毒试剂盒，其特征在于：所述S2中包含序列1和序列2；

序列1：5‘-CTTGGGAGGACGTTACCAAAACCTCTACTTAC-3’；

序列2：5‘-CTGAGTTGATAATGCCTTGCGAATGTGAGATG-3’；

序列1的5’修饰生物素标签，包括但不限于生物素的类似物；

序列2的5’修饰地高辛标签，包括但不限于地高辛的类似物；

序列1的工作浓度为0.1～0.5μmol/L，工作温度39℃；

序列2的工作浓度为0.1～0.5μmol/L，工作温度39℃；

序列1与序列2反应使用的RAA扩增试剂仅为市售成熟的产品；

序列1和序列2以及涉及的RAA反应体系反应载体包括但不限于小型金属浴，水浴锅、空气浴、小型温控设备和PCR仪；

经过上述过程，阳性样本可获得高浓度的含标签的恒温扩增产物，而阴性样本则无扩增产物产生。

5.根据权利要求2所述的可视化恒温核酸扩增快速检测猫杯状病毒试剂盒，其特征在于：所述S3中，试剂组成包括免疫胶体金、检测线T线和质控线C线；

所述免疫胶体金包括粒径10～50nm、胶体金颗粒0.5～2.5g/mL、地高辛IgG抗体(小鼠来源)0.5～20μg/mL和牛血清白蛋白0.1～5.0μg/mL；

所述检测线T线包括生物素IgG抗体(小鼠来源)0.1～1.0mg/mL、蔗糖1.0～10mg/mL、牛血清白蛋白0.05～0.5mg/mL和乙醇0.3～3.0mmol/L；

所述质控线C线包括羊抗鼠IgG抗体0.1～1.0mg/mL、蔗糖1.0～10mg/mL和乙醇0.3～3.0mmol/L；

通过采用双抗夹心法层析试纸条C/T线判断，具体地包括：胶体金表面吸附地高辛IgG抗体，特异性识别序列2的5’地高辛；检测线T线的生物素IgG抗体，可特异性识别序列1的5’生物素；RAA扩增产物的5’为地高辛与3’为生物素，地高辛与结合物释放垫上的红色免疫金颗粒特异性结合而带上红色；试纸条插入含恒温扩增产物PCR管中，若样本含有FCV核酸，核酸扩增片段的两侧相应被修饰上生物素和地高辛，在溶液层析至检测线T线时，T线的生物素IgG抗体与核酸片段另一侧的生物素特异性结合，使得T线显红色。剩余的免疫金颗粒层析至质控线C线时，C线的羊抗鼠IgG抗体与生物素抗体或地高辛抗体特异性结合，使得C线显红色，若样本不含有FCV核酸，扩增溶液中的地高辛和生物素无法结合在同一片段上，T线的生物素IgG抗体无法捕获不含生物素的免疫金颗粒而不显红色，C线的羊抗鼠IgG与地高辛抗体特异性结合，使得C线成红色，待液体移动结束后即可进行判读；

根据结果判读：

1、若T线为红色，C线也为红色，则结果判定为阳性样本；

2、若T线无色，C线红色，结果判定为阴性样本；

3、若T线为红色，C线无色，结果需重复。