[发明专利]一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法

权利要求书

1.一种肿瘤抗原肽，其特征在于，所述肿瘤抗原肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

2.一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A)使用负载肿瘤抗原肽的DC细胞与初级TILs细胞共培养，获得共培养细胞；

B)随后使用抗原特异性活化的标志物进行分选肿瘤抗原特异性T细胞，获得标志物阳性细胞；并且，

C)扩增所述标志物阳性细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标志物为CD137或CD107a或CD134，例如为CD137。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DC细胞的制备过程包括以下步骤：

(1)将外周血单个核细胞的悬液过滤后离心，加入CD14磁珠孵育，分选后获得CD14阳性细胞；

(2)将上述CD14阳性细胞使用DC细胞培养基进行重悬，而后加入定向分化因子进行分化，加入成熟因子继续进行培养；

(3)加入如权利要求1所述的肿瘤抗原肽进行共孵育，即得负载肿瘤抗原肽的DC细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中，所述外周血单个核细胞来自肿瘤患者的血细胞；和/或，

所述过滤的尺寸为35-45μm；和/或，

所述离心的条件为300-500g、5-10min；和/或，

所述孵育的温度为2-4℃；

步骤(2)中，所述DC细胞培养基为含自体血清或HSA的DC细胞培养基；和/或，

所述定向分化因子为rhGM-CSF，rhIL-4中的一种或多种；和/或，

所述成熟因子为rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-1β、rhIL-6，rhTNF-α、PGE-2和Poly I:C中的一种或多种；和/或，

所述分化的时长为3-5天；和/或，

所述培养的时长为1-6天；

步骤(3)中，所述共孵育的时长为6天。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述初级TILs细胞的制备过程包括：

(a)将肿瘤组织进行消化，获得单细胞悬液；

(b)将上述单细胞悬液和含500-6000IU/mL的IL-2的含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基A混合培养；

(c)使用所述HIPP培养基A进行换液，再培养后即得初级TILs细胞。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述HIPP培养基A为含500IU/mL的IL-2的含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基；和/或，

所述换液为半量换液；和/或，

所述换液的频率为每2-3天进行一次；和/或，

所述再培养的总时长为1-3周，例如为2周。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤A)中，将所述DC细胞与所述初级TILs细胞按1:4-1:20的比例混合，重悬在含1-5％HSA的HIPP培养基B中，并添加如权利要求1所述的肿瘤抗原肽、rhIL-21进行共培养，收集共培养细胞；

步骤B)中，利用CD137阳性细胞分选试剂，对肿瘤抗原特异性T细胞进行分离，即得标志物阳性细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

步骤A)中，所述比例为1:10；和/或，

所述HIPP培养基B为含2.5％HSA的HIPP培养基；和/或，

所述肿瘤抗原肽的终浓度为1-20μg/mL，优选为10μg/mL；和/或，

所述rh IL-21的终浓度为30ng/mL；和/或，

所述共培养的时长为12-48h，优选为18h。