[发明专利]弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法及用途在审
| 申请号： | 202211277035.0 | 申请日： | 2022-10-18 |
| 公开（公告）号： | CN115807015A | 公开（公告）日： | 2023-03-17 |
| 发明（设计）人： | 杜爱芳;阳毅敏;史悦;姚晨倩;陈学秋 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/54 | 分类号： | C12N15/54;C12N1/11;C12N15/85;A61K39/002;A61P33/02;C12R1/90 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 赵杭丽 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 弓形虫 trna 硫化 修饰 基因 除虫 构建 方法 用途 | ||
1.一种弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)出发虫株是具有tRNA硫化修饰酶基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述tRNA硫化修饰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmA质粒的构建：以pSAG1-Cas9-TgU6-sgBbs I为模板，经BbsI酶切，将上下游引物经梯度降温合成双链，使用Solution I连接、转化E.coil TOP10得到pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmA质粒，其中，上、下游引物序列分别为：
gRNA-MnmA-F：5’-AGTTGCTTCTCTGCGAGGCGAATCG-3’
gRNA-MnmA-R：5’-AAACCCGATTCGCCTCGCAGAGAAG-3’；
(3)MnmA-5UTR::DHFR::MnmA-3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，扩增MnmA-5UTR和MnmA-3UTR，通过增强型重组酶II将上述2个片段克隆至pBlue-DHFR载体，构建重组质粒pBlue-MnmA-5UTR::DHFR::MnmA-3UTR，利用MnmA-5UTR-F2、MnmA-3UTR-R2扩增MnmA-5UTR::DHFR::MnmA-3UTR同源模板，其中扩增MnmA-5UTR、MnmA-3UTR和MnmA-5UTR::DHFR::MnmA-3UTR同源模板的引物序列分别为：
MnmA-5UTR-F：CGAGGTCGACGGTATCGATA TAGATGCACGAGTTGGAGACTCGAC
MnmA-5UTR-R：GGGGTGAAAATCGAATGACA CGGCGACGCGAGGACTGAC
MnmA-3UTR-F：CAGCCCGGGGGGATCGATCC AGAGCGAGGGACTCGGCATCTTCT
MnmA-3UTR-R：GCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCAGGATTCTTCAGAACCAGATGAAGTTTTCTTCTTCCT
MnmA-5UTR-F2：TAGATGCACGAGTTGGAGACTCGACAGCTGAGGAG
MnmA-3UTR-R2：AGGATTCTTCAGAACCAGATGAAGTTTTCTTCTTCCTTAGAGGGAGAAGG；
(4)弓形虫基因敲除虫株△MnmA的获得：将步骤(2)中的pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmA和步骤(3)中的MnmA-5UTR::DHFR::MnmA-3UTR同源模板共电转至步骤(1)中所述出发虫株，通过3μM乙胺嘧啶筛选，PCR鉴定，获得tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株△MnmA，所述△MnmA敲除虫株缺失SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。
2.弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株在制备抗弓形虫基因工程疫苗中的用途，其特征在于，所述弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株是按照权利要求1所述的方法构建的。
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