[发明专利]弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法及用途

说明书

本发明公开了弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法及用途，该方法敲除了弓形虫tRNA硫化修饰酶基因，所述弓形虫tRNA硫化修饰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形虫基因敲除虫株在tRNA硫化修饰酶位点具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小的优点，对宿主的安全性较高，MnmA基因缺失虫株具有良好的免疫原性和免疫保护力，能提高动物对弓形虫的免疫能力，且免疫一次可提供长期有效的保护，有制备预防动物弓形虫病的基因工程疫苗的潜力。

技术领域

本发明涉及一种弓形虫tRNA硫化修饰酶(MnmA)基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的用途，属于生物及基因工程领域。

背景技术

隶属于顶复门的弓形虫是一种专性的胞内寄生虫，其生活史分为在中间宿主(几乎所有温血动物)细胞内发生的无性繁殖和在终末宿主(猫科动物)肠上皮细胞内发生的无性和有性繁殖，包括速殖子、缓殖子和卵囊等多个生命阶段。弓形虫病是由弓形虫感染引起的全球性人畜共患病，全球约三分之一的人口呈弓形虫血清抗体阳性，在中国约有10％的人感染弓形虫，而在某些地区，这一比例超过60％。相关调查显示，我国绵羊、山羊、马、鸡、猪、犬、猫和牛等家畜/禽中均发现弓形虫感染，并且感染率较高。珠三角地区家养猫的弓形虫病血清阳性率高达70％，带虫率高达50％。在免疫功能正常的机体中，弓形虫病多不表现临床症状，但对于免疫力低下个体和孕妇、孕畜而言，弓形虫感染能够引起严重疾病甚至死亡。母体感染的弓形虫可以直接通过胎盘垂直传播给胎儿，进而引起妊娠期间胎儿的流产、畸形胎、早产和死胎，给人类健康和畜牧业发展造成威胁。

因此，预防弓形虫病对于人类健康和畜牧业发展均具有重要意义。目前，防治弓形虫病主要依赖药物，乙胺嘧啶和磺胺嘧啶的联合用药是临床上应用最为广泛的治疗方法，两者协同阻断叶酸的合成，抑制弓形虫生长繁殖，但该疗法对宿主的副作用明显，长期使用宿主还会产生耐药性。疫苗被认为是一种最为有效且经济的预防策略，但截至目前，没有良好的疫苗用于预防弓形虫病，因此构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗对于人类生活健康和畜牧业的良性发展具有非常重要的价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种弓形虫硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了tRNA硫化修饰酶基因，毒力减小，具有良好的免疫保护效果，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

(1)本发明所述弓形虫基因敲除虫株(△MnmA虫株)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgMnmA质粒、制备MnmA-5UTR::DHFR::MnmA-3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经3μM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△MnmA；

(2)基因敲除虫株△MnmA毒力试验：以野生型虫株ME49为对照，腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1×10³个速殖子/小鼠，每组接种6只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染△MnmA敲除株的小鼠30天内没有死亡，存活率100％。

(3)不同剂量的△MnmA虫株对小鼠的毒力试验：7周龄雌性ICR小鼠每只分别腹腔接种1×10⁴、1×10⁵和1×10⁶个△MnmA敲除虫株，每组接种6只，对照组接1×10⁴个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种不同剂量的敲除株小鼠全部存活，对照组小鼠全部死亡。说明弓形虫MnmA敲除之后对小鼠的毒力下降明显。