[发明专利]一种重组转氨酶的突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种重组转氨酶的突变体及其应用。通过构建转氨酶的突变体库得到了一系列所述转氨酶突变体，并通过组合突变获得最优突变体。本发明所获得的重组转氨酶突变体催化剂能够不对称催化合成多种高附加值的N‑杂环手性胺，反应转化率最高可达99％，产物光学纯度可达99％以上。其中组合突变体的催化效果与野生型亲本和单点突变体相比活力得到大幅度提升。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和基因工程领域，具体涉及一种重组转氨酶的突变体的设计及其应用。

背景技术

光学纯N-杂环胺作为一类重要的生物活性分子，在制药工业中具有重要的应用有价值。它们可用于制备多种的生物活性药物，包括降血糖药物阿格列汀、曲格列汀和利格列汀、第四代氟喹诺酮类抗生素贝西沙星和表皮生长因子受体抑制剂纳扎替尼，因此在手性医药合成领域具有非常广泛的应用(Eckhardt,M.等,J.Med.Chem.,2007,50,6450-6453；Seganish,W.M.等,ACS Med.Chem.Lett.,2015,6,942-947；Lim,J.等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2015,25,5384-5388；Lelais,G.等,J.Med.Chem.,2016,59,6671-6689；Feng,Y.等,Org.Process Res.Dev.,2017,21(4),648-654.)。鉴于手性N-杂环胺在药物分子合成中的巨大价值，其合成技术的研发已成为新药开发领域的研究热点。

在手性N-杂环胺的合成路线中，手性氨基的引入最为关键。大量研究致力于探索这些化合物的有效合成方法，目前该类化合物的合成方法包括化学合成法和生物催化法。文献中报道的化学合成路线包括外消旋胺的动力学拆分、前手性酮的不对称合成和手性前体的氢化。传统的手性胺化学合成方法中反应步骤复杂，光学纯度差等(Hennessy,E.J.等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2012,22,1690-1694；Ji,J.等,Org.Biomol.Chem.,2015,13,7624-7627；Kumar,A.等,Der.Pharma.Chemica.,2015,7,297-300；Gundersen,M.T.等,Org.Process Res.Dev.,2016,20,602-608)。

生物催化法是利用细胞或酶蛋白为催化剂，将低值化合物催化转化为高附加值目标产物，具有立体选择性高、绿色环保等优点。近年来，用于手性胺合成的酶法策略也得到的快速发展。如借助还原胺化酶(AspRedAm)在辅酶参与下可实现手性N-杂环胺的不对称合成，但是天然来源的胺脱氢酶源较少，且催化活性普遍偏低，还无法满足工业化应用指标(Aleku,G.A.等,Nat Chem,2017,9(10),961-969)。

转氨酶(transaminase,简称TA)，又称氨基转移酶，是一类磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)依赖性的转移酶，在氨基供体存在下可以特异性将氨基选择性地转移到底物酮上，生成相应的手性胺(Simon,R.C.等,ACS Catal.2014,4(1),129-143)。转氨酶来源广泛，广泛存在于自然界中，且在反应过程中无需添加辅酶和金属离子，反应简单易操作，作为一种绿色催化剂，被广泛地应用到手性药物及其中间体的合成。然而利用转氨酶催化合成手性N-杂环胺的研究报道较少，已报到的转氨酶仅包括ATA-025-IMBCbTA TA，RbTA(CN103865964；CN108384767；Petri,A.等,Beilstein J.Org.Chem.,2019,15,60-66；Wang,C.等,ACS Omega,2021,6(26),17058-17070；Li,F.等,Adv.Synth.Catal.,2021,363(19),4582-4589)且天然来源的转氨酶催化活力偏低。如来源于光合菌(Rhodobacter sp.)的转氨酶可催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮生成(R)-N-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶，其催化活力仅为0.034U/mg，因此还无法应用于大规模的工业化生产。