[发明专利]一种乳源外泌体的制备方法

权利要求书

1.一种乳源外泌体的制备方法，以乳液为原料，其特征在于：所述的制备方法包括以下工序：

（1）去除乳液中的脂肪和乳蛋白，得到酸性乳清，其中：

先采用离心法去除乳液中的脂肪获得乳清，包括将乳液在第一离心力下进行第一级离心，第一级离心所得乳清在第二离心力下进行第二级离心，所述的第一离心力为5000g~7000g，所述的第二离心力为1500g~2500g，所述的第一级离心、所述的第二级离心的时间分别为5 min~30min；

之后使用酸性物质调节第二级离心所得的乳清的pH值至4~6使乳蛋白析出，所述酸性物质为盐酸、冰醋酸和磷酸中的一种或多种；

然后在第三离心力下进行第三级离心除去析出的乳蛋白得到所述的酸性乳清，所述的第三离心力为4500g~6500g，所述的第三级离心的时间为20 min ~40min；

（2）采用切向流超滤对所述的酸性乳清进行浓缩，得到酸性浓缩乳清，其中，所述的切向流超滤采用截留分子量为100kDa~500kDa的中空纤维柱；在采用切向流超滤前，采用微滤膜对所述的酸性乳清进行微滤，所述的微滤包括对所述的酸性乳清进行多级微滤，所述的多级微滤所采用的滤膜的孔径依次减小，所述的多级微滤包括三级微滤，第一级微滤采用的滤膜的孔径为0.5μm~0.8μm，第二级微滤采用的滤膜的孔径为0.3μm~0.5μm，第三级微滤采用的滤膜的孔径为0.2μm~0.25μm；

（3）使用碱性物质调节所述的酸性浓缩乳清的pH值至6.5~7.5，得到中性乳清；

（4）所述的中性乳清先依次经分子排阻色谱法、密度梯度离心得到外泌体梯度层，然后对所述的外泌体梯度层在离心力为100000g~200000g的条件下进行离心得到沉淀物，所述的沉淀物即为所述的乳源外泌体，所述的分子排阻色谱法采用排阻分子量为650kDa~750kDa的分子排阻色谱柱，所述的密度梯度离心采用不连续密度梯度的分层液，所述的分层液为碘克沙醇溶液，所述的分层液的质量分数自下向上依次为40%、30%、20%和10%，所述外泌体梯度层位于10%碘克沙醇溶液和20%碘克沙醇溶液界面处。

2.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（3）中，使用碱性物质调节所述的酸性浓缩乳清的pH值至6.8~7.2。

3.根据权利要求2所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（3）中，使用碱性物质调节所述的酸性浓缩乳清的pH值至7.0。

4.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（3）中，所述的碱性物质包括氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（3）中，所述的碱性物质为浓度为4mol/L~6mol/L的NaOH水溶液。

6.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（2）中，所述的浓缩的倍数为5~10倍。

7.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（1）中，使用酸性物质调节第二级离心所得的乳清的pH值至4.3~4.8。

8.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（1）中，所述的酸性物质为浓度为5mol/L~7mol/L的盐酸水溶液。

9.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（4）中，所述的分层液的表面使用PBS缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液进行封层。

10.根据权利要求1所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（4）中，所述的密度梯度离心的离心力为100000g~200000g。

11.根据权利要求1或10所述的乳源外泌体的制备方法，其特征在于：工序（4）中，所述的密度梯度离心的离心时间为5h~20h。