[发明专利]一种乳源外泌体的制备方法

说明书

本发明涉及一种乳源外泌体的制备方法。该制备方法包括：（一）去除乳液中的脂肪和乳蛋白，得到pH值为4~6的酸性乳清；（二）将酸性乳清浓缩，得到酸性浓缩乳清；（三）使用碱性物质调节酸性浓缩乳清的pH值至6.5~7.5，得到中性乳清；（四）对中性乳清进行分离纯化，得到乳源外泌体。本发明的制备方法可以在较低成本下得到更高纯度和更高收率的乳源外泌体，可为乳源外泌体的工业化制备提供思路，为天然乳源外泌体药用价值的挖掘和基于乳源外泌体的药物递送技术开发提供支持。

技术领域

本发明涉及一种外泌体的制备方法，具体涉及一种从乳液中分离获得外泌体的方法。

背景技术

细胞外囊泡（extracellular vehicles，EVs）是一种由包括真核生物、原核生物在内的大多数细胞分泌的具有膜结构的微小膜泡，根据大小和来源，主要分为外泌体、微囊泡(MVs)或微颗粒(MPs)和凋亡小体。外泌体是由多泡体(MVBs)与质膜融合而成的囊泡，MVs由质膜直接向外出芽形成，凋亡小体由细胞凋亡后释放。在过去的几十年里，EVs的生物学作用已被广泛报道。EVs是一种纳米级囊泡，它可通过膜融合、受体-配体相互作用、细胞内吞或吞噬等多种机制，将携带的生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞，因此可作为细胞间信息交流的载体，用于传递蛋白质、脂类、核酸以及代谢分子，对下游的接收细胞起到效应刺激和调节的作用。与传统的纳米材料相比，EVs具有生物相容性、生物可降解性、低毒性和非免疫原性等优点，是纳米医学中最有前景的候选者之一。

在纳米医学中，大多数研究集中于外泌体和MVs/MPs，对凋亡小体的研究较少。随着人们对细胞外囊泡研究的开展，从血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中分离的天然外泌体的功能被逐渐发现，为天然外泌体在疾病诊断和临床应用的价值的挖掘奠定了物质基础。然而外泌体的工业化提取和纯化往往需要通过昂贵的大规模细胞培养来获得更大量的上游原料，降低上游成本是外泌体制药行业面临的最大问题。相比血浆等其他来源的外泌体，乳液来源的外泌体（简称乳源外泌体），例如牛奶外泌体，具有更低的免疫原性、更高的生物兼容性、以及天然的靶向能力和良好的生物屏障渗透性等优点，同时乳源外泌体还具有来源广泛，原料成本低的优势，可成为天然药物和纳米药物的优选载体。还有文献研究报道牛奶来源的外泌体可以在胃中的强酸环境中存活，牛奶外泌体将会成为一种最具前景的口服给药载体系统。

外泌体的提取技术主要包括超速离心法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法、免疫捕获法等。超速离心根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离；密度梯度离心法利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离；化学沉淀法通过聚乙二醇（PEG）等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出；尺寸排阻法是根据外泌体大小利用色谱柱进行分离提取的方法，可以获得较为完整的外泌体。

乳液富含大量的游离蛋白质和脂肪，极易干扰外泌体的提取和纯化，上述方法为通用方法，用于乳源外泌体提取及纯化时无法同时兼顾乳源外泌体的质量和收率。保证纯度，则收率无法提高，相应地，外泌体的生产成本和使用成本高，生产效率低；保证收率，则外泌体的纯度、膜结构的完整性等质量下降，相应地，会干扰下游对乳源外泌体天然生物活性的测试，并影响基于乳源外泌体的药物递送系统的开发。

专利CN111012924 A公开了一种牛奶外泌体的制备方法，其通过离心得到脱脂奶、调酸去除酪蛋白、离心和微滤组合使用得到牛奶外泌体，该方法制备牛奶外泌体易出现损伤，且纯度不理想。

专利CN109468265 B公开了一种提取牛乳外泌体的方法，其通过离心去除乳脂层、上清液调酸并使用凝乳酶去除酪蛋白、微滤收集牛乳外泌体，该方法的产率和纯度不佳，且同样会存在牛乳外泌体损伤。

专利CN113061571 A公开了一种荷斯坦牛乳外泌体分离及鉴定的方法，其通过离心去除乳蛋白、密度梯度离心等手段的组合进行牛乳外泌体纯化，该方法虽然可以获得较好的纯度，但是操作非常繁琐，同时，外泌体的收率较低。