[发明专利]用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠及其制备方法

权利要求书

1.一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：在聚丙烯酰胺凝胶微珠的表面修饰有通用引物、细胞标签，其中

通用引物的序列为/5`Acryd//iThioMC6-D/CTACACGACGCTCTT；

细胞标签包括BC1、BC2和BC3，以及对应的辅助夹板序列BC1-RC、BC2-RC、BC3-RC；

所述BC1的序列为(X1)；

BC2的序列为GT(X2)；

BC3的序列为TG(X3)(N)_8-12TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；

BC1-RC的序列为AC(X1`)AGATCGGAAGAGCG；

BC2-RC的序列为CA(X2`)；

BC3-RC的序列为(X3`)；

其中X1与X1`、X2与X2`、X3与X3`互为反向互补序列，代表4-8bp预先设计好的序列，设计方法为每条序列之间至少有2个碱基的差异，每条序列内部没有超过连续4个重复碱基的序列，每条序列中至少有一个嘌呤和一个嘧啶。

2.根据权利要求1所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述通用引物序列、细胞标签序列修饰到聚丙烯酰胺凝胶微珠表面后进行单链化处理。

3.根据权利要求1或2所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶微珠为可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠。

4.根据权利要求3所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠在光照刺激、还原剂刺激或热刺激条件下降解。

5.根据权利要求3所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶微珠粒径在40-70μm之间。

6.一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征在于步骤包括：

(1)分别合成BC1、BC2、BC3、BC1-RC、BC2-RC、BC3-RC，以及通用引物；

(2)合成聚丙烯酰胺凝胶微珠，合成的同时加入通用引物，使通用引物偶联到聚丙烯酰胺凝胶微珠上；

(3)将BC1、BC1-RC退火，形成双链DNA，退火后的BC1/BC1-RC双链DNA通过DNA连接酶连接到步骤(2)获得的聚丙烯酰胺凝胶微珠上；

(4)重复步骤(3)，依次将BC2/BC2-RC双链DNA以及BC3/BC3-RC双链DNA连接到聚丙烯酰胺凝胶微珠上；

(5)将步骤(4)获得的双链DNA连结产物进行单链化处理，获得用于单细胞测序的功能化凝胶微珠。

7.根据权利要求6所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征为：步骤(2)中将丙烯酰胺、N,N'双(丙烯酰)胱胺、引发剂、通用引物和功能捕获核酸加入水中作为水相，包裹油、TEMED混合后作为油相，两者分别装入注射器中，与微流控芯片对应的入口端通道相连，通过控制水相和油相的流速来控制液滴生成的速率和尺寸，在微流控芯片的出口端收集生成的液滴乳浊液，在液滴乳浊液液面上覆盖矿物油，加热条件下放置8小时以上，加入PFO破坏液滴，释放聚合好的聚丙烯酰胺凝胶微珠。

8.根据权利要求7所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征为：步骤(5)中用变性缓冲液处理双链DNA连结产物，以使双链DNA连结产物中的双链变性为单链。

9.根据权利要求8所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征为：所述变性缓冲液包括150mM NaOH、0.5％Brij-35。