[发明专利]用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠及其制备方法

说明书

本发明提供了一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，凝胶微珠的表面修饰有通用引物、细胞标签，其中通用引物的序列为/5`Acryd//iThioMC6‑D/CTACACGACGCTCTT；细胞标签包括BC1、BC2和BC3，以及对应的辅助夹板序列BC1‑RC、BC2‑RC、BC3‑RC；细胞标签中X1与X1`、X2与X2`、X3与X3`互为反向互补序列，代表4‑8bp预先设计好的序列。还公开了其制备方法。本发明通过独特的生化合成手段在每个凝胶微珠上均偶联了数百万到数千万个寡核苷酸用于捕获细胞内的转录本，并且合成的每个凝胶微珠上均携带有独特的细胞标签序列用于区分单个细胞的转录本。本发明的凝胶珠制备工艺操作简单，成本低廉，寡核苷酸偶联效率高，批间差异小，适合大规模量产。

技术领域

本发明专利涉及一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

细胞是生命活动的基本结构和功能单位。对于多细胞生物而言，其不同细胞之间也是有差异的，这种差异不仅体现在形态上，也体现在细胞的遗传信息上，包括基因组的信息和基因的表达水平差异。细胞之间的这种遗传信息的差异在肿瘤细胞中尤为明显，同一肿瘤组织中的不同肿瘤细胞可以存在很多不同的基因型或者亚型，即肿瘤细胞的异质性，解析肿瘤细胞的异质性对于研究肿瘤的发生机制和诊断治疗具有十分重要的指导意义。

在人类基因组计划完成后，随着DNA测序技术尤其是高通量测序技术的发展，基因测序的成本逐渐降低，通过大规模的DNA并行测序，人们对基因组变异/基因表达差异与表型之间关系的理解认识越来越深刻。然而，传统的bulk测序针对的是对大量细胞的集合/组织进行测序，所得到的信息是大量细胞平均化后的结果，掩盖了单个细胞的遗传异质性信息。为了解决这一问题，单细胞测序应运而生。单细胞测序是指在单个细胞水平上对细胞的基因表达等信息进行检测，包括单细胞DNA测序和单细胞RNA测序。2009年汤富酬教授首次将单细胞RNA扩增和高通量测序技术结合起来，成功的对单个细胞的转录组进行测序。

目前实现单细胞测序主要有两种策略方法。第一种是直接将单个细胞分离出来，分别独立构建测序文库进行测序，可通过流式细胞分选和激光捕获显微切割来实现单个细胞的分离，前者主要用于细胞样品，后者主要用于组织样品。这种方法的局限性很明显，就是单个细胞直接建库的成本非常高，通量也很低，能研究的细胞数量很有限，而随着研究深入的需要，待测细胞的数量快速增长，成本也越来越高，基于单个细胞测序的方法无法满足研究的需要。另外一种策略基于标签(barcode)的单个细胞识别，即给每个细胞的核酸序列加上独一无二的标签，通过一次建库可以同时测定成千上万个细胞信息，在分析测序结果时把携带有相同标签的序列视为来自同一个细胞。这种策略很适合大规模的高通量单细胞分析，其关键在于细胞的捕获技术，目前最常见的有三种捕获技术：微孔(microwell)、微液流(microfluidic)和微液滴(droplet)。

2015年两篇几乎同时发表在Cell上的文章，首创基于微流控的微液滴技术应用于单细胞转录组测序，两篇文章各自把自己的技术命名为“Drop-seq”和“InDrop”，两者均通过合成带有特定cell barcode序列的微珠，与细胞一起包裹在微液滴里，然后细胞裂解释放mRNA，在液滴里完成反转录并加上barcode，用于区分每个细胞。另外一种细胞捕获方式基于微孔的方法，主要原理是通过光刻的方式来制备含有数万微孔的微孔板，然后将细胞悬液加载到微孔板上，细胞由于重力作用会落入到微孔中，一般每个微孔只能容纳1个细胞，然后再加入含有特定barcode的捕获磁珠来标记每个细胞的mRNA。目前基于droplet和microwell技术商业化最成功的例子是10x Genomics和BD Rhapsody平台，但前者技术更为成熟，捕获通量相对更高，可扩展性更高，逐渐成为目前主流的高通量单细胞测序方式。但是基于droplet技术的单细胞测序目前依然存在着诸多问题，比如用于单细胞测序最核心的微球制备成本居高不下，且制备工艺复杂，批次间不稳定，难以量产；液滴微流控技术对微球和细胞的包裹效率太低，空包率过高，这些均会对后面的单细胞测序数据结果造成很大影响，严重制约了单细胞测序技术的广泛应用。