[发明专利]一种母乳磷脂类似物的制备方法

权利要求书

1.一种母乳磷脂类似物的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

步骤1、原料磷脂的纯化：以大豆磷脂、葵花籽磷脂为原料，利用磷脂不溶于丙酮的特性向原料中加入冷丙酮，经磁力搅拌后去除上层溶液，重复上述步骤至薄层色谱法检测沉淀物中几乎无中性脂，干燥后得到较纯的大豆磷脂SPL和葵花籽磷脂SSPL；

步骤2、富含SM磷脂的富集：以乳磷脂浓缩物为原料，放入烧杯中，加入无水乙醇恒温搅拌后静置，取无水乙醇层，使用旋转蒸发仪进行旋蒸得到粗乳磷脂，再加入冷丙酮，经磁力搅拌后去除上层溶液，重复上述步骤至薄层色谱法检测沉淀物中几乎无中性脂，干燥后得到乳磷脂MPL，再利用鞘磷脂SM不溶于无水乙醚的特性对其进行富集；

步骤3、磷脂组成测定及样品制备：对富集后的磷脂进行高效液相色谱分析，测定其组成；并称取适量磷脂，制备磷脂样品；

步骤4、磷脂总脂肪酸含量测定：通过三氟化硼-甲醇法对磷脂样品的脂肪酸组成进行测定；脂肪酸分析参照标准图谱，并以占总脂肪酸的相对含量定量各脂肪酸；

步骤5、母乳磷脂类似物的调配和评价：以马氏距离法建立母乳磷脂类似物物理调配评价模型，在此模型基础上，以上述制备的磷脂样品为基料，利用Lingo 18.0软件计算调配比例，制备母乳磷脂类似物，并利用Matlab软件对制备的母乳磷脂类似物进行马氏距离评判，筛选出马氏距离最小的最佳母乳磷脂类似物配方。

2.根据权利要求1所述的一种母乳磷脂类似物的制备方法，其特征在于，步骤1中所述向原料中加入冷丙酮，冷丙酮的添加量为1:3；所述经磁力搅拌后去除上层溶液，磁力搅拌时间为30min。

3.根据权利要求1所述的一种母乳磷脂类似物的制备方法，其特征在于，步骤2中所述加入无水乙醇恒温搅拌后静置，无水乙醇的添加量为1:5，恒温搅拌温度为30℃，搅拌时间为2h，搅拌后静置12h；所述旋转蒸发仪使用温度为45℃；所述冷丙酮添加量为1:3。

4.根据权利要求1所述的一种母乳磷脂类似物的制备方法，其特征在于，步骤2所述利用鞘磷脂SM不溶于无水乙醚的特性对其进行富集，方法如下：

取适量MPL于烧杯中，加入无水乙醚，在水浴中静置浸提后，离心机离心去除无水乙醚层，重复浸提及离心3次，得到富含SM的磷脂SMPL；

所述无水乙醚添加量为1:3；所述水浴中静置浸提，水浴锅浸提温度为30℃；离心机转速为4500r/min，离心时间为15min。

5.根据权利要求1所述的一种母乳磷脂类似物的制备方法，其特征在于，步骤3中磷脂组成测定方法如下：

分别称取25mg PC、PE、SM、PI和PS标品用色谱级氯仿定容到10ml的容量瓶中，制备成2.5 mg/mL混合标品储备液；

精密量取储备液0.4ml、0.8 ml、1.6 ml、2.4 ml、3.2 ml分别置于10mL容量瓶，用色谱级氯仿定容，配制成0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mg/mL混合磷脂标品，过0.22μm的有机滤膜后进高效液相色谱分析HPLC；

高效液相色谱分析HPLC条件：

流动相A：乙腈：甲醇=100:3；

流动相B：3g/L甲酸铵水溶液；

进样量为10μL，流速为1ml/min，柱温为55℃，蒸发温度为90℃，雾化器工作温度为40℃，氮气流速为1L/min；

梯度洗脱程序：0 min 1% A， 19 min30% A，21 min 30% A，22 min1% A；磷脂样品中加色谱纯氯仿1ml，过0.22μm有机滤膜，转移至棕色进样瓶上机分析。