[发明专利]一种利用球毛壳菌DX-THS3生产β-葡萄糖苷酶的方法及应用

说明书

本发明属于真菌发酵技术领域，本发明提供了一种利用球毛壳菌DX‑THS3生产β‑葡萄糖苷酶的方法及应用。本发明通过添加不同的氮源来控制球毛壳菌DX‑THS3的形态，最终得到球毛壳菌DX‑THS3的β‑葡萄糖苷酶产量是未优化氮源的3.5倍。球毛壳菌DX‑THS3在蛋白胨7g/L条件下小圆球的直径为1.5±0.65mm，可将甘草中的异甘草苷水解转化为异甘草素。此外，本发明采用5L生物反应器进行β‑葡萄糖苷酶表达，在最佳发酵条件下，β‑葡萄糖苷酶活性可达到680U/mL，为工业化生产异甘草素时利用氮源设计丝状真菌形态提供了策略。

技术领域

本发明涉及真菌发酵技术领域，尤其涉及一种利用球毛壳菌DX-THS3生产β-葡萄糖苷酶的方法及应用。

背景技术

异甘草苷(Isoliquiritin，ISL)是甘草提取物的主要生物活性黄酮类成分之一，因其具有抗氧化、抗溃疡、治疗抑郁性精神病、艾滋病、辅助治疗糖尿病等生理活性，在食品和医药工业中得到了广泛的应用，但它的吸收率低，在动物和人体内会多种不良影响，从而限制了其应用。幸运的是，异甘草苷可以水解生成异甘草素，其生理活性更强，生物利用度更高，不良反应更少。目前，异甘草素可通过化学合成或生物转化制备。一般而言，化学合成选择性差，成本无效，会造成环境污染。异甘草苷的生物转化利用β-D-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，GUS，EC3.2.1.21)，具有高产率、高选择性和环境友好等优点，比化学合成更具潜力。因此，研究如何高效、选择性地合成异甘草苷产生异甘草素，应予以强烈考虑。

β-葡萄糖苷酶可以从众多的微生物、植物和动物中筛选得到；大多数异甘草苷生物转化的异甘草素主要是从微生物特别是丝状真菌中分离得到的，由于异甘草素含量较低，不能直接从宿主中获得。因此，发酵是利用丝状真菌生产β-葡萄糖苷酶的最有潜力的方法，但由于丝状真菌复杂的形态结构显著降低了发酵过程中的质量和氧转移，阻碍了其在生产中的应用。例如，与其他真菌形态相比，丝状真菌的颗粒形态能显著提高柠檬酸或衣康酸的产量，有证据表明真菌的丝状形态对发酵过程中异甘草素的产生有显著影响。因此，设计丝状真菌的形态成为真菌发酵大规模生产β-葡萄糖苷酶或异甘草素的挑战之一。

一般情况下，丝状真菌的形态很难控制，尤其是在生物反应器发酵过程中。丝状真菌的形态对其在发酵过程中的代谢和产物有重要影响，在液体深层发酵中，丝状真菌可以生长出多种形态，包括游离的菌丝，菌丝分散在发酵液中；光滑的、毛茸茸茸的菌丝团，核心可见高度缠绕的菌丝网络；松散的菌丝团，大的密集聚集的菌丝。丝状真菌在发酵过程中的形态会受到多种因素的影响，包括pH、培养基位置、接种量、培养基剪切、培养温度、培养基黏度等。以往的研究对丝状真菌的形态进行了研究，并试图对其进行工程化，以改善其发酵性能。但丝状真菌的形态控制尤其是在深层发酵过程中较为困难。很少有学者成功地对丝状真菌的形态进行了工程化，并报道了发酵性能的显著改善。Hasan B et al.研究表明，在曲霉发酵培养基中添加氧化铝和滑石粉可显著提高植酸酶活性。Zhang et al.研究发现，豆粕水解物作为氮源对米根霉后续发酵过程中的形态和富马酸产量有显著影响。在我们前期的研究中，我们从内生植物真菌球毛壳菌Chaetomium globosum DX-THS3中筛选出一种高效、高底物选择性的GUS(称为cg-GUS)。在摇瓶中研究了球茎藻DX-THS3发酵生产GAMG和cg-GUS的过程，球毛壳菌DX-THS3的菌体形态适合于GUS的生产。在发酵培养基中添加10g/L的二氧化硅(600目)设计球茎藻DX-THS3的颗粒形态，获得了576U/mL的GUS活性，但添加二氧化硅的过程工程面临成本不高、设备破坏、产品分离困难等挑战，给生物反应器大规模生产GUS带来困难。因此，研究一种正确合适的生产方法对于大规模生产β-葡萄糖苷酶和在不附加任何条件下设计真菌形态具有重要意义。

氮源对微生物发酵产物有重要影响。Xing et al.分析了5种氮源对延胡索酸生产的影响：他们发现不同的氮源对延胡索酸有很大的影响。Li等人报道了不同的氮源对移动发酵单胞菌发酵细胞生长、葡萄糖利用和乙醇生产有显著影响。目前，关于氮源对球毛壳菌DX-THS3发酵生产β-葡萄糖苷酶的影响还未见报道。

发明内容