[发明专利]一种防风转基因毛状根培养方法

权利要求书

1.一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 制备外植体：将防风种子消毒后，接种于培养基中，培养长成防风无菌苗，得到外植体；

S2. 制备发根农杆菌：将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；

S3. 制备转基因侵染液：将S2的转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，当OD值为0.6-1.0时，转基因侵染液制备完成；

S4. 防风毛状根的诱导：

在外植体的叶片上剪出伤口并放置于制备好的转基因侵染液当中,侵染后，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1~5天，而后将外植体用无菌水冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中除去杂菌，外植体伤口处陆续长出白色毛状根，待毛状根长到2~3cm，从叶片伤口处切下放入液体培养基中，摇床、遮光继代培养。

2.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S1中的培养基为MS固体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S1中消毒后的防风种子于培养基中培养20~40天，长成防风无菌苗。

4.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S2中，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒通过冻融法转入发根农杆菌K599感受态细胞。

5. 根据权利要求4所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞后，在含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB固体培养基上进行阳性筛选，挑取单克隆并提取质粒 DNA，引物为：F-2301AGAACCGACGACTCGTCCGT、R-2301 TCACACGTGGTGGTGGTGGT，通过 PCR 鉴定获得转基因发根农杆菌K599。

6. 根据权利要求5所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于， PCR反应程序为：95℃预变性5min，按95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min的程序进行30个循环，循环结束后72℃延伸10min。

7. 根据权利要求5所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S3中，将转基因发根农杆菌K599接种到含有卡那霉素和链霉素抗性的YEB液体培养基中，在摇床28±2℃条件下培养 2-3 d，得到活化好的转基因发根农杆菌K599。

8. 根据权利要求7所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S3中，将活化好的转基因发根农杆菌K599刮取下来并用 1/2MS 培养基重悬，使其OD值为0.6-1.0，转基因侵染液制备完成。

9. 根据权利要求7所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，所述YEB固体培养基中，卡那霉素含量为40~60mg/L，链霉素含量为40~60mg/L；所述YEB 液体培养基中，卡那霉素含量为40~60mg/L，链霉素含量为40~60mg/L。

10.根据权利要求7所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，所述YEB固体培养基中，卡那霉素含量为50mg/L，链霉素含量为50mg/L。

11.根据权利要求7所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，所述YEB液体培养基中，卡那霉素含量为50mg/L，链霉素含量为50mg/L。

12.根据权利要求1所述的一种防风转基因毛状根培养方法，其特征在于，S4中，外植体在转基因侵染液当中的侵染时间为5~20min；

或/和所述含有Cef的固体MS培养基中，Cef的含量为40~60mg/L。