[发明专利]一种防风转基因毛状根培养方法

说明书

本发明公开了一种防风转基因毛状根培养方法，属于生物技术领域。本发明的培养方法包括：S1.将防风种子消毒后培养，长成防风无菌苗；S2.将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；S3.将转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，OD值为0.6‑1.0，转基因侵染液制备完成；S4.外植体叶片上剪出伤口后放置于转基因侵染液当中侵染，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1～5天，取出，冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中，待毛状根长到2～3cm转入1/2液体培养基中培养。本发明首次通过含有pCAMBIA2301质粒的K599农杆菌诱导防风毛状根，建立了防风的转基因毛状根体系。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种防风转基因毛状根培养方法。

背景技术

防风[Saposhnikovia divaricata(Trucz.)Schischk.]是我国重要的药用植物，以未抽薹干燥的根入药，具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效。用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风等。历代本草记载认为山东、河南、湖北北部等地为防风主要产地，但现今防风产地主要是内蒙古、东北三省等地。防风主要的活性成分有升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮类以及多糖、挥发油等。防风中所含有的色原酮类成分是其发挥药效作用的主要物质基础，也是防风主要的次生代谢产物。近些年，人们发现有限的天然资源难以满足日益增长的医药及研发需求，而且长期对野生资源的采挖必然破坏生态平衡，导致天然资源的枯竭。植物组织培养技术繁殖速度快、稳定，并且以其独特优势应用于药用植物资源保护。其中毛状根、不定根培养技术是获得药用植物次生代谢产物的重要途径。

因此，提供一种防风转基因毛状根培养方法，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种防风转基因毛状根培养方法，利用含有表达载体pCAMBIA2301的K599农杆菌侵染防风无菌苗，诱导防风无菌苗得到防风毛状根，得到的防风毛状根均具有较高的生物量和色原酮含量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的一种防风转基因毛状根培养方法，包括以下步骤：

S1.制备外植体：将防风种子消毒后，接种于培养基中，培养长成防风无菌苗，得到外植体；

S2.制备发根农杆菌：将植物表达载体pCAMBIA2301质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞，再经筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌K599；

S3.制备转基因侵染液：将S2的转基因发根农杆菌K599活化后扩大培养，当OD值为0.6-1.0时，转基因侵染液制备完成；

S4.防风毛状根的诱导

在外植体的叶片上剪出伤口并放置于制备好的转基因侵染液当中,侵染后，取出，擦干，接种于MS固体培养基上共培养1～5天，而后将外植体用无菌水冲洗后转接到含有Cef的固体MS培养基中除去杂菌，外植体伤口处陆续长出白色毛状根，待毛状根长到2～3cm，从叶片伤口处切下放入液体培养基中，摇床、遮光继代培养。

本发明的部分实施方案中，S1中的培养基为MS固体培养基；

优选地，消毒后的防风种子于培养基中培养20～40天，长成防风无菌苗。

本发明的部分实施方案中，S2中，将植物表达载体pCAMBIA2301质粒通过冻融法转入发根农杆菌K599感受态细胞；