[发明专利]一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法及应用

权利要求书

1.一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：配置口腔黏液表皮样癌类器官培养基，其由Advance DMEM/F12及相关功能组分组成；

S2：获取适宜大小新鲜肿瘤标本，清洗后将组织放入预冷的取材液中浸泡，冰上或低温下保存运输标本至实验室；

S3：取步骤S2中所获得的标本进行切碎，低温离心后，取组织碎片沉淀通过解离酶Ⅰ和解离酶Ⅱ进行组织解离消化，将消化后获得的单细胞悬液进行离心，取细胞沉淀；

S4：将步骤S3中的细胞沉淀与基质胶重悬，种板固化后加入步骤S1所述的口腔黏液表皮样癌类器官培养基中进行培养，每2-3天更换类器官培养基，定期检测类器官污染及记录类器官生长状态，每10-14天进行传代培养。

2.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S1中，培养基中相关功能组分在基础培养基中的优选浓度组成为：青霉素-链霉素-两性霉素溶液，0.5-2X；HEPES缓冲液，0.5-2X；GlutaMAXTM，0.5-2X；N2补充剂，0.5-2X；B27补充剂，0.5-2X；Human FGF-10，5-20ng/ml；Human EGF，30-100ng/ml；重组Human R-Spodin-1蛋白，0.05-0.25ug/ml；重组Human Noggin蛋白，0.05-0.2ug/ml；重组Human Wnt-3A蛋白，0.05-0.2ug/ml；N-乙酰半胱氨酸，0.5-2.5mmol/L；烟酰胺，5-30mmol/L；Prostaglandin E2，0.5-1.5umol/L；A83-01，0.2-1umol/L；Butylated hydroxyanisole，2-8ng/ml；Gastrin I，0.01μmol/L；Rock抑制剂，5-20umol/L。

3.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S2中，取材液为含有20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液的DMEM培养基，在新鲜肿瘤标本切取后在20X青霉素-链霉素-两性霉素溶液预冷的DMEM培养基中浸泡并在其中切剪组织有利于降低后续原代类器官培养中出现污染的风险。

4.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，步骤S3中，解离酶I：5mg/ml的Ⅰ型胶原酶和10ug/ml的DNaseⅠ以无血清的DMEM为溶剂配置；解离酶Ⅱ：0.25％胰蛋白酶-EDTA加入10ug/ml的DNaseⅠ配置。

5.如权利要求4所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，特征在于，解离消化的具体步骤为：

S31：取步骤S2中所获得的标本，用无菌PBS清洗，在无菌培养皿中加入适量取材液，将组织切碎；

S32：将组织碎片吸至无菌离心管中，低温离心得到组织碎片沉淀；

S33：在组织碎片中加入解离酶Ⅰ，上下吹打使其混匀，37℃恒温震荡消化，低温离心后弃上清；

S34：重复步骤S33的解离酶Ⅰ消化三次后，取离心沉淀，加入解离酶Ⅱ，上下吹打使其混匀，37℃恒温震荡消化；

S35：加入含10％血清的DMEM培养基混匀，终止消化，将所获得悬液依次用细胞筛网进行过滤，低温离心后弃上清，得到细胞沉淀。

6.如权利要求1所述的一种患者源性口腔黏液表皮样癌类器官的构建方法，其特征在于，细胞沉淀中见较多红色沉淀，可加入红细胞裂解液吹打混匀，置37℃恒温震荡，加入PBS溶液稀释终止裂解液作用，低温离心弃上清。