[发明专利]一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括有寡核苷酸序列组合、阴性质控品和阳性质控品和实时荧光PCR扩增的必要试剂Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液、PCR增强剂等。本申请通过设计有通用引物Tag，可以在多重荧光扩增体系中，平衡各引物对的扩增效率，建立对ΔTREC和ΔKREC的检测，本申请检测的ΔTREC和ΔKREC指标，相比于定量TREC和KREC拷贝数，具有受样本均一性和核酸提取效率的影响较小，检测成本低的优点(不需要同步检测已知浓度的定量标准物质)，同时ΔTREC和ΔKREC在新生儿人群中的分布是正态的，具有更好的可预测性，更适合于大规模筛查应用。

技术领域

本发明属于试剂盒技术领域，具体为一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法。

背景技术

T细胞受体切除环(TREC)是T细胞受体(TCR)形成过程中基重排产生的环状DNA片段，不随T细胞的分裂而复制，稳定存在于细胞内，可以间接反映胸腺输出的初始T淋巴细胞数量，TREC可以作为伴有T细胞数量减少的T淋巴细胞免疫缺陷的筛查和诊断指标，用于新生儿原发性免疫缺陷病(Primary combined immunodeficiency，CID)等疾病的辅助诊断或筛查，KREC可以作为伴有B细胞数量减少的B淋巴细胞免疫缺陷的筛查和诊断指标，用于新生儿X连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia，XLA)等疾病的辅助诊断或筛查。

现有技术中普遍采用的筛查手段，都是基于荧光定量PCR平台的定量方式，参照外部定量标物，来定量检测特定大小新生儿干血斑中TREC和KREC拷贝数，这种方法主要根据新生儿人群中TREC和KREC拷贝数浓度的分布，将一定百分位对应的拷贝数作为阳性判断阈值，但上述方法存在以下不足：第一、通过定量绝对拷贝数来判定阴阳性，对于样本的均一性和核酸提取处理的稳定性要求较高，换言之，干血斑中血液的不均一，不同的核酸提取方法或者提取过程的不稳定都会影响检测结果；第二、定量结果的准确性依赖外部定量标物，但TREC和KREC没有可供校准的通用标准物质，因此即便使用同一套方案，甚至于同一个检测产品，通常需建议实验室在开展正式筛查前，根据前数千例新生儿样本的结果来建立或调整当前实验室的阳性判断阈值；第三、拷贝数定量结果在人群中的分布是非正态的，也是不平衡的，这并不利于统计上基于比例的阈值的估计，因此使用前期研究中建立的阈值，在正式的筛查检测中往往仍需要不断进行调整。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法，具有更好的可预测性适合大规模筛查、对TREC和KREC的检测有更高的特异性和质量稳定且可及性强易于产业化生产的优点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括有寡核苷酸序列组合、阴性质控品和阳性质控品和实时荧光PCR扩增的必要试剂Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液、PCR增强剂等。

优选的，所述寡核苷酸序列组合为：

(01)GCGTGACCTACTGACTC；

(02)GCGTGATGCATCGTACC；

(03)GCGTGACCTACTGACTCTGCTGACACCTCTGGTTTTTGTAA；

(04)GCGTGATGCATCGTACCACTCGTGAGAACGGTGAATGAAG；

(05)CCCACTCCTGTGCACGGTGATGCAT；

(06)GCGTGACCTACTGACTCAGCTCAGCGCCCATTACGTT；

(07)GCGTGATGCATCGTACCAGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT；