[发明专利]一种冬虫夏草的指纹图谱构建方法及应用

权利要求书

1.一种冬虫夏草的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取冬虫夏草药材，粉碎后加入正己烷超声提取，正己烷提取液先后用酸性和碱性无机盐溶液萃取，萃取后的正己烷提取液浓缩，用固相萃取柱吸附后洗脱，分离出甾醇类成分，收集并合并洗脱液，洗脱液回收溶剂后用甲醇-异丙醇混合溶剂溶解，用微孔滤膜过滤除菌，得到供试品溶液；

(2)对照品溶液制备：取对照品麦角甾醇、胆甾醇和谷甾醇，分别加入甲醇-异丙醇混合溶剂溶解后得对照品储备液，将三种对照品储备液以一定的体积混合均匀，用微孔滤膜过滤除菌，得到对照品混合溶液；

(3)参照物溶液制备：取冬虫夏草对照药材，粉碎后加入无水乙醇超声提取，提取液浓缩后加入甲醇-异丙醇混合溶剂溶解，用微孔滤膜过滤除菌，得到参照物溶液；

(4)高效液相色谱检测，制定冬虫夏草甾醇类成分的指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的冬虫夏草的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中高效液相色谱检测的色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：以超纯水为流动相A，以甲醇为流动相B进行梯度洗脱，所述流动相梯度洗脱条件为：0～7min，流动相中A(65％→20％)，流动相B(35％→80％)；7～15min，流动相中A(20％→0％)，流动相B(80％→100％)；15～30min，流动相中A(0％→0％)，流动相B(100％→100％)；30～35min，流动相中A(0％→35％)，流动相B(100％→65％)；35～40min，流动相中A(35％→35％)，流动相B(65％→65％)；

检测波长：216nm；

流速：0.5ml/min；

柱温：30℃；

分别精密吸取对照品混合溶液5μl、参照物溶液和供试品溶液各15μl，注入高效液相色谱仪，测定。

3.根据权利要求1或2所述的冬虫夏草的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中制定冬虫夏草甾醇类成分指纹图谱的方法为：通过对照品溶液、参照物溶液和供试品溶液色谱图中的色谱峰出峰时间和色谱峰是否存在进行比较，得出供试品溶液中的共有特征峰。

4.根据权利要求3所述的冬虫夏草的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述冬虫夏草甾醇类成分指纹图谱包括12个共有特征峰，其中，9号峰为麦角甾醇，11号峰为胆甾醇，12号峰为谷甾醇，其它为未知成分峰；

以麦角甾醇9号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：1号峰：0.579±0.029；2号峰：0.672±0.034；3号峰：0.756±0.038；4号峰：0.794±0.040；5号峰：0.814±0.041；6号峰：0.850±0.042；7号峰：0.936±0.047；8号峰：0.949±0.047；9号峰：1.000±0.05；10号峰：1.016±0.051；11号峰：1.063±0.053；12号峰：1.169±0.058。

5.根据权利要求1或2所述的冬虫夏草的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，冬虫夏草药材粉碎至约10目，每克冬虫夏草按照以下方法处理：冬虫夏草药材与正己烷的质量体积比为1.0g：100ml，超声提取使用的功率为400W，工作频率为40KHz，提取时间为30min；酸性无机盐溶液为质量体积比为1％g/ml的磷酸二氢钠水溶液，碱性无机盐溶液为质量体积比为1％g/ml的磷酸氢二钠水溶液，酸性和碱性无机盐溶液分别萃取1次；经酸性和碱性无机盐溶液萃取的正己烷提取液浓缩至2ml，固相萃取柱为C18柱，固相萃取柱先用3ml正己烷活化，然后依次用3ml的正己烷(Ⅰ)、正己烷-二氯甲烷(Ⅱ，1:1v/v)、二氯甲烷(Ⅲ)、二氯甲烷-甲醇(Ⅳ，1:1v/v)、甲醇(Ⅴ)洗脱，收集洗脱液Ⅱ和Ⅲ，回收溶剂后用2ml甲醇-异丙醇混合溶剂溶解，甲醇-异丙醇混合溶剂的体积比为1:1，用微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。