[发明专利]一种冬虫夏草的指纹图谱构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种冬虫夏草的指纹图谱构建方法及应用。包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、参照物溶液制备和高效液相色谱检测，制定冬虫夏草甾醇类成分的指纹图谱。本发明的液相色谱条件，能有效地将冬虫夏草中的甾醇类成分分离检测，分离效果佳，是首次创立的冬虫夏草中甾醇类成分的HPLC指纹图谱检测鉴别方法；该方法为冬虫夏草及其制品的真伪鉴定和/或质量控制提供有利的数据支持。

技术领域：

本发明涉及一种冬虫夏草的甾醇类成分指纹图谱构建方法和应用，属于中药检测技术领域。

背景技术：

冬虫夏草是指由冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sung，Hywel-JonesSpatafora)侵染蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫幼虫而形成的幼虫尸体与真菌子座复合体，是青藏高原特有的生物资源。现代医学表明，冬虫夏草具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗菌、抗肿瘤、护肝肾等广泛药理作用，与人参、鹿茸并称“中药三大宝”，具有悠久的使用历史，属于珍贵的滋补类中药材。由于冬虫夏草资源稀少，价格昂贵，市场上冬虫夏草药材及其制品的质量良莠不齐，以次充好，以假乱真的现象普遍存在。中国药典中冬虫夏草的质量控制仅以腺苷的含量来评价质量优劣，虽然能在一定程度上有效地保证冬虫夏草原药材的质量，但还不足以保证冬虫夏草的真伪和质量，尤其对于不具备冬虫夏草外观形态的冬虫夏草制品更难以保证其真伪和质量。

中药指纹图谱技术是一种综合地反映中药多成分特征的质量控制模式，能够准确地评价中药材质量的均一性、疗效和稳定性，具有整体性和模糊性等特点，是国内外公认的中药质量评价体系之一。目前已经有不少冬虫夏草指纹图谱相关研究，而专业文献已公开的大多是冬虫夏草水提液或醇提液的指纹图谱构建方法，如文献(钱正明等.冬虫夏草水提液和醇提液HPLC指纹图谱分析[J].世界中医药，2017年12月第12卷第12期，3133-3137.)构建了冬虫夏草水提液和醇提液的指纹图谱，文献(钱正明等.冬虫夏草中水溶性和脂溶性成分的高效液相色谱同时分析[J].时珍国医国药，2020年第31卷第7期)同时测定了水溶性和脂溶性成分的指纹图谱，类似的公开文献还有很多，但这些文献报道的冬虫夏草指纹图谱成分复杂，包含了核苷类、腺苷类、甾醇类等多种化学成分，缺乏明显的特征性，含单一类成分的活性部位的指纹图谱更有利于中药材的真伪和/或质量鉴别。

冬虫夏草含有多种化学成分，公认的活性成分主要是核苷类、甾醇类、多糖，另外还含有机酸、维生素、无机元素及其它化合物。现代药理学研究表明，甾醇类化合物具有广泛的药效活性，如抗肿瘤、降低胆固醇和预防心血管疾病等，被国际营养学会推荐为人类未来十大功能性营养成分之一，现已被广泛应用于医药、化工和食品等领域。甾醇类化合物作为冬虫夏草中的主要活性成分，应作质量控制和真伪鉴定的标志性成分，目前还没有针对冬虫夏草中甾醇类化合物构建指纹图谱应用于冬虫夏草真伪和质量鉴定的方法。专利CN201810236777构建了虫草菌粉及制剂甾醇类HPLC指纹图谱，虫草菌粉及制剂是由冬虫夏草中分离得到的一株菌株经过发酵而获得的产品，与冬虫夏草原药材及制品属于两种截然不同的产品。本发明首次构建冬虫夏草药材的甾醇类成分指纹图谱，主要应用于冬虫夏草及其制品真伪和/或质量鉴定。

发明内容：

本发明的目的在于构建冬虫夏草药材甾醇类成分指纹图谱，从而为冬虫夏草及其制品的真伪鉴定和/或质量控制提供科学依据。本发明的液相色谱条件，能有效地将冬虫夏草中的甾醇类成分分离检测，分离效果佳，是首次创立的冬虫夏草中甾醇类成分的HPLC指纹图谱检测鉴别方法；该方法为冬虫夏草及其制品的真伪鉴定和/或质量控制提供有利的数据支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种冬虫夏草的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取冬虫夏草药材，粉碎后加入正己烷超声提取，正己烷提取液先后用酸性和碱性无机盐溶液萃取，萃取后的正己烷提取液浓缩，用固相萃取柱吸附后洗脱，分离出甾醇类成分，收集并合并洗脱液，洗脱液回收溶剂后用甲醇-异丙醇混合溶剂溶解，用微孔滤膜过滤除菌，得到供试品溶液；