[发明专利]适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)初级杂交探针的设计

从待检测细胞或组织的核酸序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域，并将设计出初级杂交探针，其中，所述初级杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；

2)次级杂交探针(次级杂交探针为携带特殊标记的脱氧核糖核酸序列)的设计

根据待检测细胞或组织的核酸种类数，设计Y×N条次级杂交探针，所述次级杂交探针与初级杂交探针中的锁式探针的部分区域互补连接；其中，Y×N数值需满足待检测细胞或组织的核酸种类数，

Y为每轮杂交使用的次级杂交探针个数，Y数值由显微镜单次分辨的最多标记个数决定；

N为杂交轮数；

M为用以标记一种核酸分子所使用的次级探针种类数；

3)初级杂交探针预处理

对初级杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理，随后与RCA引发探针结合，构成初级杂交探针；

4)初级探针杂交

在待检测样本切片上制备一个反应腔室，依次进行固定、脱水和透化处理，再将含有初级杂交探针的溶液加入到反应腔室中进行杂交反应；

5)连接反应

加入连接酶反应体系，进行连接反应，使锁式探针形成闭合的环状结构；

6)滚环扩增

使用Phi29 DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，形成大量重复的核酸序列供次级杂交探针结合；

7)次级杂交探针杂交

次级探针的杂交分为N轮，每轮使用Y种带有不同标记的次级杂交探针与杂交缓冲液混合后加入反应腔室中进行杂交反应，进行下一轮杂交前使用洗涤液洗去组织中前一轮的次级杂交探针；

8)信号解读

在每一轮杂交结束后对待测样本进行成像以检测次级杂交探针所携带的标记，通过N轮杂交和成像，根据预先设计的标记组合确定每一个信号点代表的检测核酸，进而确定核酸分子在空间中的位置。

2.根据权利要求1所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中，待检测核酸序列的靶序列由3段连续的靶序列A、B和D组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为A’序列，C序列和B’序列，所述A’序列和B’序列分别与靶序列A、靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述C序列由M个barcode序列组成且分别与相应的次级探针序列相同；其中，M为用以标记一种核酸分子所使用的次级探针种类数；RCA引发探针由D’序列和E序列组成，所述D’序列与待检测核酸序列的D序列互补，E序列与锁式探针部分互补。

3.根据权利要求1所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述barcode序列之间由1个或多个碱基间隔开。

4.根据权利要求1或2所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，次级杂交探针为携带特殊标记的脱氧核糖核酸序列；且次级杂交探针的长度为10-20个碱基；

每条次级探针的核酸序列相互之间的碱基排列各不相同。

5.根据权利要求4所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，特殊标记为荧光标记、抗体标记、生物素标记、地高辛标记和特定蛋白标记中任意一种或多种，每轮杂交中的Y种次级探针所携带的特殊标记各不相同且在显微镜单次成像中可被区分。

6.根据权利要求1所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤3)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为T4D多聚核苷酸激酶T4。

7.根据权利要求1所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤5)中，连接酶为Splint R连接酶。

8.根据权利要求1所述适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤7)中，使用M类探针标记一种核酸分子。

9.一种权利要求1所述的方法在鉴定不同基因在细胞和组织内表达位置中的应用。