[发明专利]适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用，该方法首先设计出初级杂交探针，根据待检测细胞或组织的核酸种类数，设计Y×N条次级杂交探针，所述次级杂交探针与初级杂交探针中的锁式探针的部分区域互补连接；其中，Y×N数值需满足待检测细胞或组织的核酸种类数，进行N轮的荧光探针与靶基因杂交，解读每个组合两种荧光的共定位，确定空间上不同种类核酸分子的分布，该方法可通过N轮的杂交，达到了同时检测最多种核酸分子的目的，且信号强度高，信号的解读不依赖超分辨成像平台，实现了检测成本、检测轮数、检测通量和信号强度之间的平衡，推动了原位空间转录组的普及和发展。

技术领域

本发明涉及原位杂交领域，具体涉及一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法及其应用。

背景技术

从1975年第一代测序技术的发明到2005年起二代测序技术的兴起，核酸测序获得的海量数据推动了生命科学的高速发展。而对核酸的检测方法也不断进步，单细胞测序技术的发明实现了在单个细胞水平上对转录组或基因组进行扩增并测序，但是难以获取核酸分子在空间位置上的分布信息。研究表明，核酸分子在组织和细胞的空间分布与功能紧密联系，在空间水平检测核酸分子具有重要意义。

目前主流的原位空间组学检测方法有单分子荧光原位杂交(smFISH)、序贯荧光原位杂交(seqFISH)、杂交链式反应(HCR)以及STARmap(Spatially-resolved TranscriptAmplicon Readout Mapping)等。但目前的方法仍然存在下列问题：

1.smFISH被认为是核酸检测的行业标准，其原理是直接使用荧光标记的探针对RNA进行原位杂交。该类方法的成像需要针对每个基因设计至少24个荧光探针，而且由于未对信号进行放大，其检测需要借助于超分辨荧光显微镜，对技术要求和成均有较高要求，此外此类方法难以进行高通量检测。

2.seqFISH技术的技术特点是通过对基因预先进行N位的编码，随后在1～N轮杂交过程中呈现每个基因的1～N轮编码，进一步识别不同的核酸分子。该方法具有通量高、检测效率高的优点，但是与smFISH类似，该方法也需要借助超分辨显微镜，且需要繁琐的多轮杂交和成像，成本相对较高。

3.STARmap运用锁式探针对核酸分子结合，然后通过滚环扩增的方式对杂交的信号进行放大，进一步用原位测序的方法来展示空间转录组，通过连接测序的方式对探针序列进行解读。该方法的优势是检测通量高、信号强度高，可运用普通共聚焦进行成像，但是该方法相对基于杂交的检测方法而言效率较低，通过连接测序的方法耗时较长。

发明内容

本发明针对现有技术显微镜单次只能分辨有限的标记种类(Y种)，而传统方法通过标记探针逐轮检测在N轮以后只能识别Y×N种核酸分子，连接测序耗时长和直接杂交信号强度低的缺陷，提供了一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，本发明兼顾技术难度、检测成本和检测通量，基于滚环扩增(RCA)放大信号，通过在Y×N种次级探针中选取不重复的M种作为一个组合用以标记一类核酸分子，进行N轮的荧光探针与靶基因杂交，解读每个组合M种标记的共定位(即一类核酸分子)，进一步可以确定空间上不同种类核酸分子的分布，该方法可通过N轮的杂交，达到了同时检测最多种核酸分子的目的，且信号强度高，信号的解读不依赖超分辨成像平台，实现了检测成本、检测轮数、检测通量和信号强度之间的平衡，推动了原位空间转录组的普及和发展。

为实现上述目的，本发明所设计一种适用于中通量核酸空间位置信息的检测方法，包括以下步骤：

1)初级杂交探针的设计

从待检测细胞或组织的核酸序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域，并将设计出初级杂交探针，其中，所述初级杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；

2)次级杂交探针(次级杂交探针为携带特殊标记的脱氧核糖核酸序列)的设计