[发明专利]一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用在审
| 申请号： | 202211335564.1 | 申请日： | 2022-10-28 |
| 公开（公告）号： | CN115806925A | 公开（公告）日： | 2023-03-17 |
| 发明（设计）人： | 柳志强;杨辉;张博;吴梓丹;潘佳园;陈立峰;郑裕国 | 申请（专利权）人： | 浙江工业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/54;C12N15/31;C12P13/12;C12R1/19 |
| 代理公司： | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人： | 冷红梅 |
| 地址： | 310000 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高产 半胱氨酸 基因工程 构建 方法 应用 | ||
1.一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株，将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaRI70V和AHL合成酶esaI，在基因esaRI70V后添加终止子Tlpd，在基因esaI后添加终止子TrpoC，得到菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI；
(2)将菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI的cysM基因和nrdH基因的启动子替换为PTrc启动子，得到菌株E.coilW3110EYC::esaRI70V::esaI::cysM::nrdHΔlacI；
(3)将质粒pTrc99a-PTrc-cysE-ydeD-serC-cysB上的基因lacI的启动子替换为PesaS，并在基因lacI的终止密码子前添加LAA降解标签，构建得到发酵质粒pTrc99a-PesaS-lacI(LAA)-PTrc-cysE-ydeD-serC-cysB，其中LAA为降解标签，将其导入将步骤(2)所得菌株中，得到E.coilW3110::esaRI70V::esaI::PTrc-cysM::PTrc-nrdHΔlacI/pTrc99a-PesaS-lacI(LAA)-PTrc-cysE-ydeD-serC-cysB，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于所述转录调节因子esaRI70V的序列如SEQ ID NO.1所示，所述AHL合成酶esaI的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.构建权利要求1所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)以菌株E.coil W3110为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将其基因组上的lacI基因替换成转录调节因子esaRI70V和AHL合成酶esaI，在基因esaRI70V后添加终止子Tlpd，在基因esaI后添加终止子TrpoC，得到菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株E.coil W3110::esaRI70V::esaIΔlacI的cysM基因和nrdH基因的启动子替换为PTrc启动子，得到菌株E.coilW3110EYC::esaRI70V::esaI::cysM::nrdHΔlacI；
(3)将质粒pTrc99a-PTrc-cysE-ydeD-serC-cysB上的基因lacI的启动子替换为PesaS，并在基因lacI的终止密码子前添加LAA降解标签，构建得到发酵质粒pTrc99a-PesaS-lacI(LAA)-PTrc-cysE-ydeD-serC-cysB，将其导入将步骤(2)所得菌株中，得到E.coilW3110::esaRI70V::esaI::PTrc-cysM::PTrc-nrdHΔlacI/pTrc99a-PesaS-lacI(LAA)-PTrc-cysE-ydeD-serC-cysB，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述转录调节因子esaRI70V的序列如SEQ IDNO.1所示，所述AHL合成酶esaI的序列如SEQ ID NO.2所示。
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