[发明专利]一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明通过将Esa群体感应系统和乳糖操纵子系统进行整合，构建了一个多功能的QSI动态调控系统，实现了靶基因表达与细胞生长的偶联，并应用到L‑半胱氨酸的生物合成当中，获得了一株高产L‑半胱氨酸的大肠杆菌基因工程菌株。此外，本发明所构建QSI动态控制系统，利用群体感应系统动态地控制乳糖操纵子系统，替代了传统诱导剂IPTG的添加，有效的节约了工业生产的成本和降低了诱导剂IPTG对细胞的毒性影响，具有较好的生产应用价值。

(一)技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法，及其在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。

(二)背景技术

L-半胱氨酸(L-Cys)是生物体内常见的硫源供体，其L型具有生物学活性。L-Cys是蛋氨酸、硫胺素以及谷胱甘肽等生物体内常见物质的重要组成成分。L-Cys通过形成二硫键和蛋白质过硫酸化在蛋白质折叠、组装和信号转导中发挥重要作用。此外，L-Cys在氧化压力下对细胞起保护作用。作为生物体中一种重要氨基酸，L-Cys在医药、食品、化妆品和饲料行业中有广泛应用。例如L-半胱氨酸衍生药物有镇咳退热，消炎化痰，抑菌生长等作用，还能防治皮肤病，改善化疗造成的伤害等多种功能。L-Cys也可作为面包添加剂、增香剂和发色剂等食品添加剂大量使用。

相比工业化方法生产L-Cys的繁琐步骤以及对环境的污染，微生物的发酵方法已经成为一种极具前景的生产技术。由于L-Cys自身对细胞的毒性以及具有还原铁和驱动芬顿化学的理化性质等因素，细菌严格调节其细胞质水平，导致野生型大肠杆菌中原始的L-Cys积累水平很低，所以采用微生物发酵的方法依然面临着巨大的挑战。L-Cys的生物合成途径和调节机制已被广泛研究。因此通过基因工程、代谢工程等生物技术对L-Cys生产菌株进行改造，以减轻L-Cys对于细胞自身的毒性和提高L-Cys代谢途径的通量，是一种有效的得到L-Cys高产菌株的策略。

代谢工程控制微生物的细胞代谢，以最大限度地生产增值产品，同时也可能会导致细胞代谢网络失衡，从而降低生产率和产量。代谢通量可以通过动态调节来重新平衡，群体感应(QS)系统被认为是一种由细胞密度调节的自动诱导系统。特定的信号小分子在细胞中积累，诱导QS回路的激活，可用于动态调节目标基因的表达。群体感应功能控制细菌中的细胞密度依赖过程，并已应用于诱导重组蛋白表达、控制赖氨酸和平衡多个细胞群体等。Esa群体感应系统被用于下调相互竞争的代谢途径以及控制lacI的表达。小分子AHL由AHL合成酶EsaI产生。在AHL浓度水平较低的情况下，转录调节因子EsaR可以与启动子P_esaS结合并激活其转录。随着细胞的生长，AHL逐渐实现积累，EsaR能够与AHL结合形成复合物。这种复合物的形成会导致EsaR对启动子PesaS的激活作用丧失，从而无法激活启动子PesaS的转录，实现表达水平的下调。

在许多工程菌株中，启动子P_Trc通常用于驱动基因过表达。P_Trc是一种常见的杂合启动子，其转录受到LacI蛋白的抑制。在IPTG诱导下，阻遏蛋白LacI可以与IPTG结合形成复合物，无法继续与P_Trc启动子上的乳糖操纵子结合位点结合，从而导致P_Trc启动子的转录。但是使用诱导剂这种基因表达方式也存在一些缺陷，比如在大规模的工业生产中，使用诱导剂的成本较高，且此类诱导具有不可逆性，一经添加便会长期存在于介质中，只能起到单次控制的效果。此外，需要定期监测细胞生长状况已确定最佳的诱导时间较为烦琐等。这些缺陷给传统合成生物学的工业化造成了一定的障碍。

(三)发明内容

针对上述问题，本专利构建了QSI动态调控系统，并应用到生产L-半胱氨酸的大肠杆菌工程化菌株中，获得一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌。

为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：