[发明专利]一种菌藻共生球总RNA的提取方法

说明书

一种菌藻共生球总RNA的提取方法，包括以下步骤：将菌藻共生球置于无菌预冷研钵中，加入菌藻共生球质量的1～3倍的石英砂和液氮(使菌藻共生球全部浸没在液氮中)后，迅速充分研磨得到细胞匀浆，离心后收集细胞匀浆上清液，用于后续总RNA提取；所述菌藻共生球为霉菌与微藻共生培养形成。本发明通过加入石英砂结合液氮对菌藻共生球进行速冻研磨，代替了单纯的液氮研磨或石英砂研磨，使得RNA提取时对菌藻共生球的需求量大大降低，显著缩短了研磨耗时。该方法还有利于将菌藻共生球研磨成粉末，提高菌藻共生球研磨后细胞匀浆与RNA isolater提取剂的充分接触，进而减少总RNA提取物中细胞外膜多糖和蛋白质的残留量，提高菌藻共生球总RNA的提取浓度和质量。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种菌藻共生球总RNA的提取方法。

背景技术

微藻是自然界分布最广的微生物，它们可以在压力大的环境条件下生长，例如如在重金属污染、高盐度、营养胁迫和极端温度，微藻的细胞壁富含以多糖为主的细胞外聚合物(EPS)，蛋白质和核酸，可以与带电金属离子、重金属和有机污染物结合，微藻具有良好的生物吸附潜力。

从悬浮液中收获藻类的方法有多种，如离心法、重力沉淀法、自然加压过滤法、化学絮凝法、电絮凝法和真空过滤法等。然而，这些方法效率低，能耗高，不适合大规模工业化回收微藻，且微藻细胞体积小(直径30um)和细胞间静电斥力等不良特性，显著地限制了微藻实现大规模商业化生产的经济可行性和可持续性。

真菌能形成球状去吸附培养液中的微藻形成真菌-微藻共生菌丝球，其菌丝可以用作固定化微藻的载体材料，有利于从培养基中将球团过滤分离出来进而降低了微藻采收过程的运营成本，丝状真菌与微藻互利共生还能提高了微藻的生物量并降低培养成本，和微藻形成真菌-微藻共生系统。因此，将藻类与丝状真菌共培养成为了一种高效收获微藻的新方法。

目前，真菌-微藻共生菌丝球在微藻采收和重金属处理方面有显著优势，但关于解析转录水平的分子机制尚未有详细报道，其中之一的问题在于：丝状真菌菌体层层加厚，常见的液氮研磨无法快速、充分地将真菌-微藻共生菌丝球分散成粉末，且，传统的SDS法和CTAB法无法大量提取RNA，容易因残留的多糖、糖蛋白而影响提取后总RNA的纯度，进而导致共生菌丝球总RNA提取的效率和质量均偏低，同时直接影响到转录组测序结果的准确性。但是目前关于共生菌丝球总RNA的提取并没有一种广泛认可且有效的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种操作简单，安全、有效、快速且污染少的菌藻共生球总RNA的提取方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种菌藻共生球总RNA的提取方法，包括以下步骤：

1)细胞匀浆处理：将菌藻共生球置于无菌预冷研钵中，加入菌藻共生球质量的1～3倍的石英砂和液氮(使菌藻共生球全部浸没在液氮中)后，迅速充分研磨得到细胞匀浆，离心后收集细胞匀浆上清液，备用；所述菌藻共生球为霉菌与微藻共生培养形成；

2)将步骤1)得到的细胞匀浆上清液转入离心管，按每5～10×10⁶个细胞加入1mLRNA isolater，静置5～10min；待样品完全融化后，再继续吹打至裂解液透明；

3)将裂解液转移至离心管中，12000×g、4℃离心5min，吸取裂解液上清；由于菌藻共生球经石英砂和液氮研磨后，匀浆样品中含有较多蛋白、多糖等成分，离心去除包括真菌细胞外膜多糖、高分子量DNA等杂质组成的沉淀，通过收集裂解液上清进而对菌藻共生球的总RNA进行初步富集。

4)向步骤3)的裂解液上清中加入500～700μl的氯仿/异戊醇，涡旋混合后，4℃静置10min以上；12000×g、4℃离心10min，使裂解液中的含有RNA的水相和有机相高效分开，RNA在管底或管侧壁上形成胶状沉淀，去除上清液，