[发明专利]一种FNR突变体及其在基因表达调控中的应用

说明书

本发明公开了一种FNR突变体及其在基因表达调控中的应用。所述突变体为在所述FNR的氨基酸序列上具有R169G和/或G216D突变，所述FNR的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，或与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有99％同一性。本发明的FNR突变体FNR(R169G)和FNR(G216D)可以实现对PfnrS启动子更为严格的调控，解决了该启动子有氧条件下的泄露表达造成的问题，提高了菌株生长和表达的稳定性。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种FNR突变体、含其的核酸构建体、含其的基因修饰的细胞及其在基因表达调控中的应用，以及一种提高FNR依赖型启动子调控严谨性的方法。

背景技术

在大肠杆菌中，FNR蛋白(富马酸酯和硝酸盐还原调节子/剂)是控制从有氧至无氧代谢开关的主要转录活化物。在无氧状态下，FNR二聚化为活性DNA结合蛋白，其活化数百个负责适应厌氧生长的基因。在有氧状态下，FNR被氧气阻止二聚化并且是失活的。

在无氧和/或低氧条件下，FNR形成二聚体并且与I类或II类FNR依赖型启动子(Class I or Class II FNR-dependent promoter)中的特定序列结合，从而活化基因的表达。其中II类FNR依赖型启动子中与FNR结合的一致性位点(concensus site)位于转录起始位点上游41bp附近，而I类FNR依赖型启动子的结合位点则位于更上游的位置；然而，在有氧条件下，氧与FNR二聚体中的铁硫簇(Iron-sulfur cluster)反应，并且将其转化为非活性形式。以这种方式，FNR依赖型启动子适于调节蛋白或RNA的表达。

Spiro S等人(Spiro S,Guest J R.FNR and its role in oxygen-regulatedgene expression in Escherichia coli[J].FEMS microbiology reviews,1990,6(4):399-428.)的研究表明即使在有氧情况下细胞中也存在活性FNR的基础水平，当FNR合成被放大时，活性FNR会增加。因此FNR调控基因表达时，在有氧环境中，存在目的基因泄露表达的情况，也即是存在FNR调控不严谨的情况。

为了使FNR作为转录调节物，更为精准的调控后续基因的表达，本领域技术人员已经尝试多种改造方法。Tim Overton等人(Transcription Activation at Escherichiacoli FNR-Dependent Promoters by the Gonococcal FNR Protein:Effects of a NovelS18F Substitution and Comparisons with the Corresponding Substitution inE.coli FNR，JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Aug.2003,p.4734–4747)发现淋病奈瑟氏菌FNR中S18F的突变能够增强铁硫簇的稳定性，从而提高在有氧和无氧条件下的活性。

CN102724988B通过突变组成型活性FNR，即使在不限制氧水平时也能导致FNR-激活基因如fhbp的过度表达，从而促进脑膜炎球菌fhbp基因的过度表达。

以上对FNR的改进侧重于在有氧环境下，维持或激活FNR的活性，以促进目的基因的表达，但是提高FNR对氧气到敏感性，降低有氧环境下FNR的活性，从而降低其泄露表达，以提高FNR依赖型启动子的调控严谨性的需求，一直未被满足。