[发明专利]一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在：包括如下步骤：

步骤1：设计并筛选检测虾急性肝胰腺坏死病的引物组和特异性荧光探针：

选取急性肝胰腺坏死病致病质粒中，长度1665bp的pirAB序列作为检测靶基因，设计RT-ERA引物组和RT-ERA荧光型探针；

步骤2：RT-ERA检测：以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤1)设计的RT-ERA引物组和探针，在33℃-42℃下进行恒温RT-ERA扩增，得到RT-ERA扩增产物，检测其荧光信号强度，根据15min内的扩增曲线的荧光信号值，判断扩增结果。

2.如权利要求1所述的一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在于：所述RT-ERA引物组的上下游引物的序列长度各为28-35个核苷酸，GC含量在40％-60％之间。

3.如权利要求2所述的一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在于：所述RT-ERA引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示。

4.如权利要求1所述的一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在于：所述RT-ERA荧光型探针的序列长度为46-52个核甘酸，RT-ERA荧光型探针序列中，含有THF残基、dT-荧光团和dT-淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基。

5.如权利要求4所述的一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在于：所述RT-ERA荧光型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。

6.如权利要求1所述的一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在于：所述RT-ERA检测方法，具体步骤如下：

(1)RT-ERA扩增：配制RT-ERA反应管：取溶解剂、RT-ERA引物组、RT-ERA荧光型探针、模板和ddH₂0；加入含ERA反应试剂的RT-ERA反应管中，震荡混匀，并在每个反应管盖上加入激活剂，离心混匀后迅速将反应管置于便携式荧光扩增检测仪器中，33℃-42℃下进行恒温RT-ERA扩增反应，得到RT-ERA扩增产物；

(2)荧光信号检测：若在RT-ERA扩增的15min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为感染或候选感染ANPND；若RT-ERA扩增产物不满足上述条件，则表明扩增结果显示为未感染或候选未感染AHPND。

7.如权利要求6所述的一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，其特征在于：所述RT-ERA反应管中，包括20μL溶解剂、浓度为10μM的RT-ERA引物组2μL、浓度为10μM的探针0.6μL、2μL模板和21.4μL ddH₂0；激活剂用量为2μL。

8.一种如权利要求1-3中任意一项所述的基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，在对虾急性肝胰腺坏死病的预防和控制中的应用。