[发明专利]一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用

说明书

本发明提供一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用，包括：(1)取急性肝胰腺坏死病致病质粒中，长度1665bp的pirAB序列作为检测靶基因，设计并筛选RT‑ERA引物组和RT‑ERA荧光型探针；(2)以待测样品的基因组DNA为模板，用设计的RT‑ERA引物组和探针，在33℃‑42℃下恒温RT‑ERA扩增，RT‑ERA扩增产物，检测荧光信号强度，根据15min内的扩增曲线的荧光信号值，判断扩增结果；本发明利用实时定量酶促重组扩增技术RT‑ERA建立AHPND检测体系，可在33℃‑42℃下高效扩增，20min内即可得到检测结果，具有较高的特异性且检出限大大降低，操作更加简便。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用_。

背景技术

我国是南美白对虾等养殖虾的主要生产国。自2009年以来，一种称为急性肝胰腺坏死病(AHPND)的细菌性疾病的出现导致对虾产量下降和严重的经济损失。AHPND的特点是突然大量死亡(高达100％)，通常幼苗在养殖池中放养30-35天后受到影响。引起AHPND的细菌最初寄居在受感染虾的胃中，随后这些细菌产生的二元毒素在一定程度上通过胃筛进入肝胰腺。受AHPND影响的虾表现出嗜睡、厌食、生长缓慢、消化道空虚和肝胰腺苍白至白色。2013年，AHPND的病原体被确定为副溶血性弧菌。病原体携带无毒pVA1质粒(69kbp)，该毒力质粒能编码一种二元毒素，与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫毒素Cry蛋白相似。pirA和pirB毒素蛋白是引起AHPND的主要致病因子，除了这些毒素基因，质粒还编码结合转移基因和转座子，表明质粒具有转移至其他菌株或物种的潜力。近期研究信息表明，pVA1质粒和变体也存在于许多其他弧菌物种中，如坎贝弧菌、哈维弧菌和欧文弧菌。随着AHPND在中国、马来西亚、泰国、菲律宾、越南、美国等多国的对虾生产中爆发，给对虾养殖产业造成了严重的经济损失。

传统的AHPND诊断方法，包括组织病理学、聚合酶链反应(PCR)、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)、单克隆抗体测定、生物传感器和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但因需要较长的反应时间、复杂的仪器和专业的操作，而均不适合对虾场进行现场检查。

近年来，等温扩增技术逐渐应用于AHPND的检测中，如环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)等，然而LAMP靶向序列为小片段内的6个或8个区域，因此，引物设计受到许多限制，易面临被污染的高风险可能，RPA与凝胶电泳技术相结合，增加了检测时间且低浓度下容易出现非特异性扩增。因此，进一步开发快速、灵敏高的实时定量酶促恒温扩增技术(RT-ERA)的AHPND检测方法，有利于更好地实现对本病的预防和控制_。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法及应用，是利用实时定量酶促重组扩增技术(RT-ERA)建立了AHPND检测体系，不仅可快速实地实时检测，且具有较高的特异性和效率。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种基于ERA技术的急性肝胰腺坏死病病原的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：设计并筛选检测虾急性肝胰腺坏死病的引物组和特异性荧光探针：

选取急性肝胰腺坏死病致病质粒中，长度1665bp的pirAB序列作为检测靶基因，设计RT-ERA引物组和RT-ERA荧光型探针；通过基础型扩增与荧光型扩增筛选出最优引物组与探针。

步骤2：RT-ERA检测：以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤1)设计的RT-ERA引物组和探针，在33℃-42℃下进行恒温RT-ERA扩增，得到RT-ERA扩增产物，检测其荧光信号强度，根据15min内的扩增曲线的荧光信号值，判断扩增结果。