[发明专利]一种生产咖啡酸的重组大肠杆菌及应用

权利要求书

1.一种合成咖啡酸的重组大肠杆菌，其特征在于，对大肠杆菌出发菌株进行了如下至少一种改进：

(1)表达来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)的酪氨酸解氨酶和大肠杆菌BL21(DE3)内源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶；

(2)表达来源于皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)的酪氨酸解氨酶；

(3)过表达大肠杆菌来源的FAD合成酶和运动发酵单胞菌(Zymomonas.mobilis)来源的分支酸变位酶；

(4)过表达大肠杆菌来源的外排蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还表达来源于大肠杆菌的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体；编码所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体的基因aroG^fbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶具有Genbank登录号：WP_012023194.1所示的氨基酸序列；所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶具有Genbank登录号：WP_000801472.1和WP_001175451.1所示的氨基酸序列；所述酪氨酸解氨酶具有Genbank登录号：AKE50834.1所示的氨基酸序列；所述FAD合成酶具有Genbank登录号：WP_123902793.1所示的氨基酸序列；所述分支酸变位酶具有Genbank登录号：AAA27684.1所示的氨基酸序列；所述外排蛋白具有Genbank登录号：ARH97076.1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述FjTAL和hpaBC之间具有SEQ ID NO.8所示的RBS。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以质粒pACYCDuet或pCDFDuet-1表达FjTAL和hpaBC基因。

6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以质粒pETDuet-1表达aroG突变体基因aroG^fbr。

7.根据权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以敲除了tyrR基因的大肠杆菌BL21(DE3)ΔtyrR为出发菌株；或

以敲除了tyrR、ptsG、crr和pheA的大肠杆菌BL21(DE3)ΔtyrRΔcrrΔptsGΔpheA为出发菌株。

8.一种生产咖啡酸的方法，其特征在于，利用权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌发酵生产咖啡酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，加入IPTG诱导，培养至少48h。

10.权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌或权利要求8～9任一所述的方法在生产咖啡酸或其衍生物中的应用。