[发明专利]一种生产咖啡酸的重组大肠杆菌及应用

说明书

本发明公开了一种生产咖啡酸的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明在大肠杆菌中异源表达约氏黄杆菌的酪氨酸解氨酶FjTAL和大肠杆菌BL21(DE3)内源的hpaBC，实现了咖啡酸的合成；并通过过量表达来源于皮状丝孢酵母的酪氨酸解氨酶TcTAL，减少了咖啡酸合成的中间产物的积累；通过敲除咖啡酸合成前体物酪氨酸合成的竞争途径，强化辅因子的合成和过表达多酚转运蛋白，使咖啡酸的产量得到明显提高。本发明构建的工程菌株咖啡酸的产量可达775.7mg/L，为工业化生产咖啡酸及其衍生物提供了一种新的方法。

技术领域

本发明涉及一种生产咖啡酸的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸)是一种天然的苯丙素类化合物，具有很多重要的药用价值。咖啡酸被广泛用作抗氧化剂和抗炎试剂。此外，咖啡酸的衍生物迷迭香酸也具有重要的抗氧化、抗血栓生成、抗菌和抗病毒等重要的生理活性。

咖啡酸的主要生产方式为植物提取，但是生产过程耗能高、对环境不友好。化学合成咖啡酸通常以3,4-二羟基苯甲醛和丙二酸为底物，以甲苯为溶剂，以吡啶为催化剂，对环境不友好且收率较低。因此，可以考虑采用绿色的、可持续的微生物发酵法生产咖啡酸。咖啡酸的合成可以分为两个阶段，一是葡萄糖或甘油通过糖酵解途径和磷酸戊糖途径以及莽草酸途径合成酪氨酸，二是酪氨酸经过连续的脱氨和羟基化修饰生成咖啡酸。目前已有研究咖啡酸的生物合成，但是其产量仍然受到中间产物积累过多、辅因子合成受限和产物耐受性差等问题。因此，如何利用生物法合成咖啡酸并且获得较高的产量是目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种合成咖啡酸的重组大肠杆菌，对大肠杆菌出发菌株进行了如下至少一种改进：

(1)表达来源于约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)的酪氨酸解氨酶和大肠杆菌BL21(DE3)内源的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶；

(2)表达来源于皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)的酪氨酸解氨酶；

(3)过表达大肠杆菌内源BL21(DE3)的FAD合成酶和运动发酵单胞菌(Zymomonas.mobilis)来源的分支酸变位酶；

(4)过表达大肠杆菌来源的外排蛋白。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达来源于大肠杆菌的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroG^fbr，以解除苯丙氨酸反馈抑制；所述基因aroG^fbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述酪氨酸解氨酶具有Genbank登录号：WP_012023194.1所示的氨基酸序列，其编码基因FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶具有Genbank登录号：WP_000801472.1和WP_001175451.1所示的氨基酸序列，其编码基因hpaBC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述酪氨酸解氨酶具有Genbank登录号：AKE50834.1所示的氨基酸序列，其编码基因TcTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述FAD合成酶具有Genbank登录号：CP081489.1所示的氨基酸序列；所述分支酸变位酶具有Genbank登录号：AAA27684.1所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述FAD合成酶的编码基因为ribF基因；所述分支酸变位酶的编码基因为tyrC基因；所述ribF、tyrC基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。