[发明专利]一种表达11β-HSD1酶突变体的大肠杆菌基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达11β‑HSD1酶突变体的大肠杆菌基因工程菌及其应用。其中，所述11β‑HSD1酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明公开了一种利用11β‑HSD1酶突变体制备醋酸氢化可的松的方法。本发明通过定向进化得到11β‑HSD1酶突变体，用于制备醋酸氢化可的松时活性好，产物产量较高，达到88.2％。

技术领域

本发明涉及化学物质和生物转化领域，具体涉及一种表达11β-HSD1酶突变体的大肠杆菌基因工程菌、利用其制备醋酸氢化可的松的方法以及所述基因工程菌的应用。

背景技术

11β-HSD1为11β-羟基类固醇脱氢酶1型，也称为可的松还原酶，是可的松转化为功能性糖皮质激素皮质醇的关键酶。这种激活与几种人类疾病有关，尤其是代谢综合征，其中11β-HSD1已被确定为潜在治疗药物的新靶点。

根据文献报道，目前合成可的松系列甾体药物(氢化可的松、醋酸氢化可的松、泼尼松龙等)的方法有：全化学合成法、半合成法及全生物合成的方法。但是全化学合成法工艺复杂，总收率低，而无工业生产价值；全生物合成法也因为合成途径复杂，产物得率较低也并没有实现工业化生产。因此半合成法成为国内外合成可的松系列甾体药物的主流方法。

本发明挖掘得到一种11β-HSD1酶突变体可用于醋酸氢化可的松的合成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是工业化生产醋酸氢化可的松时工艺复杂或总收率低。为此，本发明提供了一种表达11β-HSD1酶突变体的大肠杆菌基因工程菌、利用其制备醋酸氢化可的松的方法以及所述基因工程菌的应用。本发明通过定向进化得到11β-HSD1酶突变体，用于制备醋酸氢化可的松时活性好，产物产量较高，达到88.2％。

本发明第一方面提供了一种基于大肠杆菌(Escherichia coli)的基因工程菌，其中，所述的基因工程菌包含表达编码11β-HSD1酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在某一方案中，所述基因位于重组表达载体中；优选地，制备所述重组表达载体所用的骨架质粒为pRSFDuet1。

在某一方案中，所述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21。

在本发明的某一方面中，还包括构建所述基因工程菌的方法。

所述的方法包括如下步骤：将合成的含11β-HSD1酶突变体基因的重组表达载体，通过转化例如化学转化的方法(例如氯化钙法)转入宿主细胞例如大肠杆菌BL21，即可。

所述的方法中，培养所述基因工程菌的条件优选为：37℃，培养36h以上。

本发明第二方面提供了一种生产11β-HSD1酶突变体的方法，其中，通过培养如本发明第一方面所述的基因工程菌，使其发酵，即得所述11β-HSD1酶突变体。

在某一方案中，所述发酵包括如下条件的一种或多种：

(1)培养基为2×YT固体选择培养基；

(2)加入种子液的浓度为1％；

(3)发酵条件为37℃，200rpm振荡培养0.5～2天；

较佳地，所述11β-HSD1酶突变体存在于基因工程菌悬浊液中，所述基因工程菌悬浊液的制备优选包括以下步骤：离心收集所述基因工程菌，洗涤后重悬于PBS缓冲液中；更佳地，所述PBS缓冲液的浓度为0.1M。

其中，所述的2×YT固体选择培养基的配方为16g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，5g/L氯化钠，20g/L琼脂；所述的2×YT液体选择培养基的配方为16g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，5g/L氯化钠。