[发明专利]一种小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种检测小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）根据7条小熊猫细小病毒的VP1基因序列进行序列比对，根据结果选择病毒的保守序列区域设计特异性引物RPAV-VP1-PF和RPAV-VP1-PR，RPAV-QPF和RPAV-QPR；其核苷酸序列分别如Seq_1~ Seq_4所示；

（2）以小熊猫细小病毒的DNA为模板，采用步骤（1）设计的特异性引物RPAV-VP1-PF和RPAV-VP1-PR进行PCR扩增获得目的基因VP1的 DNA片段；

（3）将PCR扩增产物纯化，与酶切后线性化的质粒载体pcDNA3.1HA连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，获得重组质粒pcDNA3.1HA-RPAV-VP1标准品；

（4）将重组质粒pcDNA3.1HA-RPAV-VP1进行10倍倍比稀释得到重组质粒标准品溶液，并以其为模板，采用特异性引物RPAV-QPF和RPAV-QPR进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR，以重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，得到线性回归方程；

（5）以待测样本的DNA为模板，采用特异性引物RPAV-QPF和RPAV-QPR进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR，并将获得的Ct值带入步骤（4）所构建的线性回归方程，实现待测样本中小熊猫细小病毒的实时荧光定量检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板5μL，RPAV-VP1-PF 1μL，RPAV-VP1-PR1μL，Prime STAR25μL，ddH₂O添加至50μL。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增的反应程序为：预变性98℃3min，变性98℃20s、退火60℃20s、延伸72℃ 2min35个循环，延伸72℃10min，保存16℃ 2min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述DNA片段的大小为2037bp。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述重组质粒标准品溶液的浓度为8.34×10¹~8.34×10⁸ copies/μL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述的线性回归方程为y=-3.1557x+36.419。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系均为：2×SYBR Green Ⅰ Mix 5μL，上游引物RPAV-QPF(10 μM) 0.05μL，下游引物RPAV-QPF(10μM) 0.05μL，DNA模板1μL，无核酸酶水（ddH₂O）3.9μL。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序均为：95℃30s，95℃10s、60℃30s 40个循环，95℃15s、60℃60s。

9.一种用于小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测的通用性引物，其特征在于，所述通用性引物为RPAV-VP1和RPAV-Q；所述RPAV-VP1的上游引物为RPAV-VP1-PF，其核苷酸序列如序列表中Seq_1所示，下游引物为RPAV-VP1-PR，其核苷酸序列如序列表中Seq_2所示；所述RPAV-Q的上游引物为RPAV-QPF，其核苷酸序列如序列表中Seq_3所示，下游引物为RPAV-QPR，其核苷酸序列如序列表中Seq_4所示。

10.一种用于小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求8中所述的通用性引物。