[发明专利]一种小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法。本发明根据RPAV VP1的基因序列设计并合成特异性引物，构建重组质粒pcDNA3.1HA‑RPAV‑VP1，作为标准品建立标准曲线，构建针对小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测体系，实现RPAV的特异性检测。能够检测到10supgt;1/supgt; copies/μL的重组质粒。具有特异性和敏感性高、重复性好及耗时短的优点。检测结果可直接通过电脑软件读出，简化实验步骤节约检测时间。为检测小熊猫细小病毒提供了一种新的检测方法，弥补熊猫细小病毒检测的技术空白，为诊断小熊猫细小病毒感染提供依据，在保护小熊猫及大熊猫方面发挥重要作用。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

细小病毒是组成细小病毒科（ Parvoviridae）的一个动物病毒科，是一类无包膜的单链线性DNA病毒，在所有的轴对称DNA病毒中，细小病毒是最小病毒之一，病毒粒子直径为18 ~ 26nm。细小病毒基因组长约4kb ~ 6.3kb，其GC含量约为40% ~ 55%，包括5’端非编码区、两个开放阅读框（ORF1、ORF2）和3’端非编码区，其中ORF1通过可变剪接编码非结构蛋白NS， ORF2编码结构蛋白VP。目前， 细小病毒科根据宿主不同分为两个亚科， 即感染脊椎动物及其细胞培养物的细小病毒亚科（ Parvovirinae）和感染节肢动物的浓病毒亚科（ Densovirnae）。细小病毒可引起动物的多种疾病，犬细小病毒和猫细小病毒分别在狗和猫中引起严重的疾病导致死亡，猪细小病毒是导致猪不孕症的主要原因，人类博卡病毒则是急性呼吸道疾病的常见原因，尤其在幼儿急性呼吸道疾病中常见。细小病毒对环境有较强的抵抗能力，是威胁动物乃至人类健康的重要传染病源之一。

近年来，成都大熊猫繁育研究基地中频繁出现小熊猫（ Ailurus fulgens）死亡事件。在前期研究中采用新兴的宏基因组学方法对死亡小熊猫进行研究，进行DNA文库构建并进行高通量测序，通过对测序结果进行生物信息学分析获得7条细小病毒的基因组全长，其完整NS1和VP2氨基酸序列分别具有87.99% ~ 99.84%和92.19% ~ 98.90%的同一性。系统发育分析结果表明新发现的7条细小病毒可能代表阿留申病毒属（ Amdoparvovirus）的一个新物种，取名为小熊猫细小病毒（Red Panda Amdoparvovirus，RPAV）。对于四川成都大熊猫繁育研究基地中大熊猫及相关生物的病毒宏基因组学研究发现，在同一生态系统中大熊猫及其相关生物体内病毒的广泛传播，存在频繁的病毒跨物种传播。小熊猫细小病毒是一些小熊猫患病或死亡的原因，对小熊猫的健康与生命构成巨大威胁，并存在感染大熊猫种群的可能。

目前，对于细小病毒科阿留申病毒属新成员小熊猫细小病毒的研究尚处于萌芽阶段，尚未建立完善的检测方法。实时荧光定量PCR方法是国际公认检测病毒的方法之一，具有快速简便、特意性强、灵敏度高、重复性好和定量准确等优点。建立新型小熊猫细小病毒的定量PCR检测方法可以填补对于此病毒检测方法的技术空白，有助于对RPAV开展广泛的分子生物学检测，对及时阻断RPAV传播，保护小熊猫及大熊猫健康起重大作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中的存在的问题，提供一种小熊猫细小病毒（RPAV）的实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法可以实现对待检样本中的小熊猫细小病毒进行定量检测，具有快速快、灵敏度高、特异性强等多项技术特点。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种检测小熊猫细小病毒的实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括如下步骤：