[发明专利]一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备

说明书

本发明公开了一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备，属于生物工程技术领域。本发明通过将所述腈水合酶β亚基上的第37位的苯丙氨酸、第48号位的亮氨酸和/或α亚基上的第89位谷氨酰胺进行突变，得到突变体F37P‑L48A、F37P‑L48P、F37P‑L48T和Q89N的催化肉桂腈的酶活达到了46.5U/mL～53.6U/mL，较野生型腈水合酶的酶活提升了9.3～10.72倍。本发明中的突变体F37P‑L48A、F37P‑L48P、F37P‑L48T和Q89N对于肉桂腈具有较好的催化活性，具有良好的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种腈水合酶底物通道氨基酸基序的改造用于肉桂酰胺的制备，属于生物工程技术领域。

背景技术

携带独特酰胺基团的酰胺类物质，拥有特殊的生理功能和潜在的生物活性，是合成大量精细化工品、多聚体和合成中间体的优势资源。目前，已经开发了许多合成方法用于酰胺类物质的制备。肉桂酰胺及其衍生物的合成就是其中经典的案例，它们可以作为很多天然产物的载体支架。比如，这类支架可以作为有效的模板用于设计和生产新型的具有药理活性的药物类分子。目前，肉桂酰胺及其衍生物的获取在工业生产中主要还是以传统的化学合成为主，有关生物酶法催化的文献报道非常少。在化学法生产过程中，操作比较繁琐，并且需要极端温度、强碱、有毒试剂三乙胺等。这些苛刻的反应条件安全系数低，与绿色生产理念不一致，急需改善。

腈类是合成中的宝贵中间体，它们可以较为容易地从许多简单、直接和经济高效的合成方法中获得。腈水合酶(Nitrilehydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在烟酰胺和丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，酰胺类的生物法生产技术以其绿色环保、反应条件温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，符合可持续发展和绿色生产理念。

腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。尤其是对于像肉桂腈这样较大位阻的底物，活性更低。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明通过对来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶的底物通道氨基酸进行改造，以期能拓宽底物谱并提升催化性能。

本发明提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基，以来源于Pseudonocardia thermophila的腈水合酶PtNHase为亲本；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体为将β亚基的第37苯丙氨酸、β亚基的第48位亮氨酸或α亚基的第89位谷氨酰胺中的至少一处进行突变。

在一种实施方式中，所述突变体为如下(a)～(e)任一所述：

(a)所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸和第48位亮氨酸突变发生取代；

(b)所述突变体为将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；

(c)所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸、第48位亮氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；

(d)所述突变体为将β亚基的第37位苯丙氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代；

(e)所述突变体为将β亚基的第48位亮氨酸和将α亚基的第89位谷氨酰胺突变发生取代。

在一种实施方式中，所述突变体为将β亚基的第37位突变为脯氨酸或缬氨酸，第48位突变为丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸或苏氨酸。