[发明专利]一种催化生成天冬氨酸的双酶共固定化系统及其构建和应用

说明书

本发明公开了一种催化生成天冬氨酸的双酶共固定化系统及其构建和应用，双酶共固定化系统以金属有机框架为载体，将热稳定双酶AaMaiA和AspB交联到金属有机框架上得到双酶共固定产物AaMaiA/AspB@NH₂‑UiO66，热稳定双酶AaMaiA和AspB氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明双酶共固定化系统对有机试剂耐受，其中还对苯甲醛表现出良好的耐受能力，同时具有良好的重复使用性；与全细胞催化相比对底物马来酸的转化率大大提高，固定化酶的转化率为86.8％。本发明双酶共固定化系统可以避免其他副产物的生成，得到纯度高且产率高的天冬氨酸，降低成本、避免底物浪费，生产过程更为简单。

技术领域

本发明属于生物催化合成，具体涉及一种催化生成天冬氨酸的双酶共固定化系统及其构建和应用。

背景技术

天冬氨酸，又称天门冬氨酸，是一种α-氨基酸，天门冬氨酸的左旋异构物是20种蛋白氨基酸之一，是蛋白质的构造单位。天冬氨酸能调节脑和神经的代谢功能，其左旋体L-天冬氨酸广泛用做氨解毒剂，肝机能促进剂，疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂；其外消旋体DL-天冬氨酸(DL-Asp)可用于合成DL-天冬氨酸钾镁盐(脉安定)，可用于治疗心律失常、心动过速、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、肝炎和肝硬化等疾病。DL-天冬氨酸还可作为合成多肽的原料，它的氨基酸的取代衍生物(NMDLA)可以作为治疗神经类疾病和大脑疾病的药物，如天冬氨酸的衍生物N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)能明显增强视神经单元放电单元的兴奋作用，可作为哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋神经递质受体之一。天门冬氨酸在医药，食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，可以用于治疗心脏病，肝脏病，高血压症，具有防止和恢复疲劳的作用，和多种氨基酸一起，制成氨基酸输液，用作氨解毒剂，肝功能促进剂，疲劳恢复剂。在食品工业方面，是一种良好的营养增补剂，添加于各种清凉饮料，也是甜味素(阿斯巴甜)的主要原料。阿斯巴甜的甜度大约是蔗糖的200倍，属于低热量甜味剂中的一种，和其他甜味剂相比具有味质佳、安全性高、热量低等优点。人食用之后,代谢分解成为氨基酸，适用于糖尿病、高血压及肥胖人群，广泛应用于各类减肥食品及饮料中。在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，也可作为化妆品的营养性添加剂等,还是合成高分子材料聚天冬氨酸的前体。

近年来已经有很多关于生物酶催化转化天冬氨酸的研究报告，有以富马酸为底物的单酶催化法，也有以马来酸为底物的双酶催化法。双酶联法以其许多优点引起了科学家的兴趣，与常规酶法生物合成相比，不需要对中间产物进行分离纯化，可以大大提高生产效率，降低成本。此外，设计合成级联通常比进行代谢工程更简单。在生成天冬氨酸的底物中，马来酸的价格比富马酸更加低廉，更容易获得，因此以马来酸为底物的双酶联法更加受到青睐。ABDULLAH等在2004年提出了两步生物法催化马来酸生产L-天冬氨酸，首先用马来酸顺反异构酶催化马来酸生成富马酸，然后用天冬氨酸裂解酶催化富马酸加氨生成L-天冬氨酸铵，再用浓硫酸中和过量的氨，获得L-天冬氨酸，该方法在一定程度上实现了节能减排，但是需要对两种菌同时进行发酵培养，然后混合催化，操作较繁琐，生产成本较高，不适于实际工业生产。目前，国外关于双酶偶联催化生成天冬氨酸的报道较少，国内相关报道相对较多。刘祥涛等在2017年提出了“一锅双酶”法制备L-天冬氨酸，双酶共表达的极不平衡和目前报道的马来酸顺反异构酶稳定性差、酶活低、表达量低等缺点，极大地限制了该方法在工业生产中的应用。Zhongmei Liu、Yu Long等在2019年提出了双酶催化生成天冬氨酸的优化方法,他们选择了选择了来自S.Marcescens的MaiA和来自大肠杆菌的AspA进行酶联，但此报道中，MaiA和AspA组成的双酶系统重复利用率较低，另外，马来酸顺反异构酶和天冬氨酸酶均属于常温酶，常温条件下，催化过程中会生成较多复杂副产物，如苹果酸等降低产物生成率并增加产物纯化成本，而耐高温的酶可解决这一问题。高温条件下，细胞中的大部分酶均会失活，不具备催化能力，从而无法生成目标产物以外的其他副产物，获得单一的天冬氨酸生成物。此外，上述文献中对MaiA做了突变，细胞催化会产生较多的副产物，不利于纯化产物，另外重复利用差。

发明内容