[发明专利]HEK293单克隆细胞群的培养方法

说明书

本发明涉及一种HEK293单克隆细胞群的培养方法。本发明通过采用第一培养基和第二培养基对HEK293细胞进行培养，仅需4‑6周即可完成从单克隆铺板到获得HEK293悬浮单克隆细胞群的步骤，且成克隆率高达50％‑70％，适合商业环境下单克隆细胞株的短时间高通量筛选。

技术领域

本发明涉及单克隆细胞筛选和培养领域，具体涉及HEK293单克隆细胞群的培养方法。

背景技术

复杂的生物药物生产基本上都是依赖于哺乳动物细胞系，其中CHO细胞系因为其技术发展较早相对成熟，成为主流细胞系。CHO细胞表达蛋白转录后修饰与人源蛋白存在明显差别，尤其在糖型修饰方面，对药效存在不利影响。因此并不是所有的重组蛋白都适合用CHO细胞表达(Swiech,Picanco-Castro et al.2012)。人源细胞系表达人源性重组蛋白，其翻译后修饰更接近天然的人源蛋白，所以人源细胞系越来越受到人们的关注。在人源细胞系中，HEK293(The human embryonic kidney cell line)因其转染效率高、生长速度快以及可实现高密度悬浮无血清培养而被广泛关注。自2015年以来FDA批准了7种HEK细胞衍生产品(Tan,Chin et al.2021)。

自1973年以来，通过研究者的不懈努力，目前已经衍生出的HEK393细胞系有11种之多，并且已经能购买到适应无血清悬浮培养的商业化HEK293细胞。不同于CHO细胞系，目前市售商业化HEK293细胞系以瞬时表达为主。近年来对HEK293细胞系的研究不断深入，GS筛选系统和DHFR筛选系统(李景传,薛博夫,袁媛,等,2015)均有报道用于HEK293细胞稳定表达细胞株的筛选(Abaandou,Quan et al.2021)。但与CHO细胞相比，HEK293细胞在重组蛋白表达方面起步较晚，相关技术并不成熟。

在单克隆细胞筛选方面，CHO细胞单克隆细胞株筛选技术相对成熟，市售多款针对悬浮单克隆筛选培养基。HEK293细胞相关技术发展较晚，HEK293细胞多采用贴壁细胞进行稳定转染及单克隆筛选，后经过悬浮驯化，用于蛋白稳定表达。此方法涉及到细胞消化及单克隆驯化，步骤繁琐且耗费时间，不利用HEK293细胞的商业化应用。目前没有针对HEK293悬浮单克隆细胞群的培养方法。

发明内容

本发明提供了一种针对HEK293悬浮细胞的单克隆细胞群的培养方法，旨在解决现有的HEK293单克隆细胞群的筛选和培养存在耗时长、成本高的问题。

相应地，本发明提供了一种HEK293单克隆细胞群的培养方法，其包括如下步骤：

(1)利用有限稀释法，将HEK293细胞进行单克隆铺板，以第一培养基进行培养；

(2)选取阳性克隆孔；

(3)以第二培养基对所述阳性克隆孔中的细胞进行扩增培养，得到HEK293单克隆细胞群；

其中，所述第一培养基为添加有FBS(胎牛血清)的DMEM培养基和/或MEM培养基；

所述第二培养基包含FreeStyle293培养基(FreeStyle293表达培养基(FreeStyle293Expression medium)，本文简称“FreeStyle293培养基”)。