[发明专利]检测人EGFR基因第20外显子插入突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明属于基因检测技术领域，提供一种检测人EGFR基因第20外显子插入突变的引物探针组合物、试剂盒及方法，引物探针组合物，包括：探针E20ins‑Ref‑P、E20ins‑MT‑P1、E20ins‑MT‑P2、E20ins‑MT‑P3、E20ins‑MT‑P4、E20ins‑MT‑P5；分别检测内参基因、p.V769_D770insASV突变、p.D770_N771insSVD突变、p.H773_V774insH突变、p.H773_V774insNPH突变以及p.D770_N771insG突变。本发明基于数字PCR技术，用于检测EGFR基因20号外显子插入突变，包含了5种常见的EGFR基因20号外显子插入突变类型，针对每种插入突变设计各自的特异性探针，可有效提高检测特异性，同时本方法可实现五种插入突变类型在一个反应管中完成检测。检测效率高，特异性好，灵敏度高，并且可将突变频率结果直观的呈现出来，对NSCLC患者的精准用药指导有着重要意义。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体地，本发明涉及一种检测人EGFR基因第20外显子插入突变的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为ErbB家族的四个成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。因此，以表皮生长因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。

EGFR激酶结构域18-21外显子突变是非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)确定的驱动突变基因，EGFR最常见的典型突变是19外显子缺失突变(exon19deletion,Ex19del)和21外显子氨基酸替换L858R的错义突变(exon 21 pointmutation,L858R)，携带此类突变的NSCLC患者对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)高度敏感；其他确定的非典型突变EGFR S768I、L861Q和G719X对TKIs中度敏感，但表现出异质性和降低的反应；而20外显子的T790M突变和部分外显子20插入突变(exon 20insertions,Ex20ins)对TKIs不敏感，属于耐药突变。EGFR基因20号外显子插入或缺失突变在肺癌患者中占比为4％到12％，属于第三高频的基因突变类型，具有重要的研究意义。

EGFR第20外显子插入突变(E20ins)占肺癌EGFR突变的10％；其中，94.7％的E20ins插入发生在EGFR环区，从位于aC螺旋c末端的p.A767残基开始，并且以三种不同的形式高度多样化：插入、缺失-插入(delins)和重复，插入突变频率最高的是p.A767_V769dup(25.1％)和p.S768_D770dup(17.6％)。

目前对于EGFR基因第20外显子插入突变的检测常用的方法有NGS和荧光PCR。NGS是一种高通量大规模并行测序方法，它可以同时检测多种基因靶标，然而，其价格昂贵、复杂，既费时又费力。荧光PCR技术虽然简便快捷，但无法绝对定量，给出突变频率，且灵敏度有时不足。

而且，现有技术中对EGFR基因20号外显子突变检测的通常是与18号外显子、19外显子放在一起研究，例如发明专利(专利申请)CN108220442B、CN112322733A、CN114277142A等，研究得并不深入，没有针对20号外显子的不同突变位点进行针对性检测，导致检测效果并不理想。也有针对20号外显子的某一特定突变位点进行检测，例如CN109652505A公开的针对人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的检测，检测效果单一。