[发明专利]Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法

权利要求书

1.用于Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的Cas9/sgRNA靶点，其特征在于为如下任一：

Gas5-1：TAATGGGTCACCTCAAGTGA

Gas5-2：TTTCTGAGGTGCCTGGATGG

Gas5-3：ATGGAGGCTCAAATAGAAGA

Gas5-4：TCTGTGGCAAAGGAGGATGA

Gas5-5：CACAAGATGTCCCATCACAG

Gas5-6：ATAATGGTTTGAATAAAGAA。

2.Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法，其特征在于包含下述步骤：

步骤一、构建Gas5全身敲除小鼠；

步骤二、利用步骤一所得的小鼠构建肾纤维化小鼠模型。

3.根据权利要求2所述的Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法，其特征在于：所述步骤一的构建Gas5全身敲除小鼠包括以下步骤：

1.1)、体外设计构建sgRNA；

获得小鼠的Gas5基因序列，设计针对Gas5基因的sgRNA序列；

1.2)体外受精及胚胎移植：

运用血清和人绒毛膜促性腺激素促使雌性小鼠超数排卵后与雄性小鼠合笼，次日挑取见栓雌鼠剪取双侧输卵管获得受精卵，并将其置于显微注射操作系统中；将sgRNA与Cas9蛋白混合后调整至适宜浓度，注射至受精卵原核；

1.3)F0代小鼠出生及鉴定：

将经显微注射后培养存活的受精卵通过输卵管伞端移植入假孕雌鼠体内，19～21d后小鼠出生剪尾提取DNA，PCR及测序进行基因型鉴定筛选，获得F0代小鼠；

剪取F0代小鼠鼠尾，提取鼠尾DNA，进行基因鉴定，满足在以位于Gas5基因的上下游的F1、R1引物进行PCR扩增后，在凝胶电泳中于1490bp和352bp处皆见条带的为F0代Gas5基因敲除杂合子Gas5+/-小鼠；

1.4)阳性F0代小鼠配繁以及F1代小鼠的出生及鉴定：

F0代雌、雄性Gas5基因敲除杂合子Gas5+/-小鼠交配，获得F1代；

F1代杂合小鼠雌雄近交，后代基因型鉴定获得F2代纯合子基因敲除小鼠、杂合子基因敲除小鼠、野生型小鼠。

4.根据权利要求3所述的Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法，其特征在于所述1.1)：Cas9/sgRNA设计靶点为如下：

5.根据权利要求2～4任一所述的Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法，其特征在于所述步骤二的构建肾纤维化小鼠模型为：通过结扎小鼠单侧输尿管构建肾纤维化模型，从而获得C57BL/6Gas5 KO肾纤维化小鼠。

6.根据权利要求5所述的Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法，其特征在于：对C57BL/6Gas5 KO肾纤维化小鼠进行表型鉴定分析。