[发明专利]Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法

说明书

本发明属于生物领域，具体涉及Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化模型的方法。本发明提供了用于Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的Cas9/sgRNA靶点，本发明还提供了Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化的方法。本发明运用CRISPR‑Cas9技术构建lncRNA Gas5敲除的纯合子(Gas5‑/‑)以及杂合子(Gas5+/‑)小鼠，从而为探究lncRNA Gas5在肾纤维化中的作用及其机制研究提供了理想的动物模型基础。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化模型的方法。

背景技术

基因编辑技术是利用人工设计的核酸酶对基因组定点修饰，其修饰手段包括基因敲除、敲入、单碱基编辑、引导编辑等。近年来，基因编辑技术飞速发展。从锌指核酸酶(Zincfindernucleases,ZFNs)技术到类转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like effectornucleases,TALEN)技术，再到突破性的规律成簇的间隔短回文重复及其相关蛋白(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat/associated protein,CRISPR/Cas9)系统，基因编辑水平日益成熟。CRISPR/Cas系统来源于细菌和古细菌，是为抵御噬菌体病毒和外源质粒DNA入侵的一种适应性免疫系统，它通过小段RNA(sgRNA)与宿主DNA识别并借助Cas9核酸酶对基因进行高效的靶向编辑。该系统主要工作原理是通过tracrRNA与crRNA结合形成复合物，招募引导Cas9蛋白定点切割DNA序列。近年来，研究人员进一步将tracrRNA与crRNA组成的复合RNA进行融合改造，成为仅有一条RNA链的引导RNA(single guide RNA,sgRNA)。在sgRNA的引导下，Cas蛋白扫描寻找靶标DNA上的一段保守原间隔序列(Protospacer Adjacent Motif,PAM)，当sgRNA与双链DNA发生碱基互补配对时，Cas9的2个核酸酶催化中心对靶序列切割，产生DNA双链断裂(DoubleStrandBreaks,DSBs)，进而激发细胞内源的非同源末端连接(Non-homologous End-Joining,NHEJ)或同源重组(Homology-Directed Repair,HDR)修复机制，实现对靶标基因的定点编辑。相比于传统的基因编辑方法，其使用更加高效简便，已被广泛应用于医学及动物、植物育种等领域，目前成为了基因编辑领域的主流技术。

生长抑制特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5,Gas5)位于染色体1q25位点，最初是通过筛选潜在的肿瘤抑制基因发现而命名。Gas5基因有31个转录本，其中20个为保守的内含子，11个为长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNA)。lncRNAGas5表达于多种组织器官，参与机体组织器官的发育和多种细胞的生物学功能，调控细胞增殖、凋亡、细胞周期等生命过程，既往大多研究皆集中于Gas5与肿瘤、心血管疾病发生发展的关联研究。近年来，越来越多的文献提出lncRNA Gas5与肾纤维化存在紧密联系。

然而，目前关于Gas5参与体内的肾纤维化的作用机制尚未完全阐明，仍需要在整体和活体水平进一步研究。小鼠作为模式动物在基因功能研究方面起着重要作用，目前以Gas5基因全身敲除的小鼠构建肾纤维化模型还没有文献报道。以全身性的Gas5基因敲除小鼠构建肾纤维化模型，并对其表型进行初步分析，为后续在体内研究Gas5对肾纤维化的作用及机制提供良好的途径与基础。