[发明专利]莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法

说明书

本发明公开了一种莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法。其中LAMP检测引物组合物由正向内引物MrFIP、反向内引物MrFIP、正向外引物MrF3、反向外引物MrB3、正向环引物MrLoopF以及反向环引物MrLoopB组成；利用上述引物对莱氏绿僵菌进行扩增，检测结束后即可通过观察反应液的颜色对结果进行判定。本发明根据莱氏绿僵菌的β‑tubin基因序列设计特异性引物组合，采用LAMP技术进行可视化检测，具有灵敏度高、特异性强、方便快捷等优点，有助于快速鉴定区分莱氏绿僵菌，对鳞翅目有害昆虫生物防治药剂开发和评估具有重要意义。

技术领域

本发明属于病原真菌的分子生物学检测技术领域，具体涉及莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法。

背景技术

莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)，又称为莱氏蛾霉，是一种典型的双性型昆虫病原真菌，主要侵染以夜蛾科Noctuoidea为主的60多种鳞翅目Lepidoptera农业害虫幼虫，包括重要农林城市害虫棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、淡剑灰翅夜蛾等。该菌在自然条件下侵染死亡率高，条件适宜时可引起田间流行病，可有效控制害虫在经济损害阈值以下，因此莱氏绿僵菌的研究开发越来越受重视。目前已经分离得到了对草地贪夜蛾、淡剑灰翅夜蛾、斜纹夜蛾等具有致病性的莱氏绿僵菌菌株，但不同寄主及区域来源菌株的致病性常有较大差异。为了进一步开发莱氏绿僵菌对农业害虫的生防潜力，筛选和评估适宜的生物农药生产菌株，有必要进一步开发快速便捷的莱氏绿僵菌检测和监测技术。

目前，常用的菌株鉴定检测方法为形态鉴定和分子生物学鉴定(PCR)，其中传统形态鉴定需要耗费大量的时间和精力，灵敏度低，容易受到人为或环境等因素的干扰，且鉴定局限于纯菌株的的分离获得。而分子生物学的鉴定检测已开发出了常规PCR、巢式PCR以及实时荧光定量PCR法等不同方法技术，这类方法虽然较传统形态学显著缩短了鉴定时间，提高了准确度和灵敏性，但是其依赖于精密、价值较高的PCR，甚至昂贵的定量PCR仪才能进行；且鉴定/检测过程较为复杂，传统PCR还需要凝胶电泳等后续处理。如中国专利CN105349692A公开了一种检测Lactobacillusparacasei N1115菌株的引物对方法，中国专利CN114350750A公开了一种样品菌株鉴定方法，这些检测仪鉴定方法均需要多种程序才能确定结果。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增，同时其依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的多条引物和一种链置换DNA聚合酶即可一步完成扩增与检测，特异性较高、所需时间短，是一种简单快捷、精准的基因扩增方法。该方法不依赖高精仪器设备，依靠颜色变化可肉眼直接判断结果，目前已经被用来检测青枯菌(CN106893764A)、梨孢镰刀菌(CN106893763A)、小麦白粉菌(CN108103153B)等多种微生物，但是目前尚未有针对莱氏绿僵菌的LAMP检测引物及检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法，其引物组合物的特异性高，利用引物组合物可以高灵敏度的检测到莱氏绿僵菌，且检测结果可视化。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种莱氏绿僵菌的LAMP检测引物组合物，由正向内引物MrFIP，反向内引物MrFIP，正向外引物MrF3，反向外引物MrB3，正向环引物MrLoopF以及反向环引物MrLoopB组成，各引物序列如下：

MrF3：SEQ ID No.1；

MrB3：SEQ ID No.2；

MrFIP：SEQ ID No.3；

MrBIP：SEQ ID No.4；

MrLoopF：SEQ ID No.5；