[发明专利]EMP3作为治疗慢性肾脏病的靶点用途

说明书

本发明提供了一种靶向EMP3基因mRNA的sgRNA以及相应的CRISPR‑Cas13d系统，基因编辑效率高，能够有效抑制小鼠TCMK1细胞以及肾脏组织中EMP3的表达，作为一种EMP3抑制剂，通过基因编辑能够显著延缓慢性肾脏病肾纤维化的进展，为临床治疗慢性肾脏病肾纤维化提供了新的靶点和治疗策略。

技术领域

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种抑制EMP3作为治疗慢性肾脏病的靶点用途。

背景技术

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是由多种原因引起的，以肾脏结构损伤和功能障碍为主要特征的慢性疾病，而CKD进展后可发展为肾纤维化。肾纤维化是以正常肾单位丢失、大量成纤维细胞及肌成纤维细胞增生、细胞外基质堆积而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化为特征的一种病理生理改变，是引起终末期肾功能衰竭的主要原因。目前，临床上尚缺乏治疗或延缓肾纤维化的有效手段。

上皮膜蛋白3(Epithelial membrane protein 3，EMP3)基因是外周髓磷脂蛋白PMP22基因家族成员。人类EMP3基因位于染色体19q13.3，编码163个氨基酸的髓磷脂相关上皮膜蛋白3。EMP3基因编码蛋白的功能，与调节细胞增殖、分化、激活凋亡通路以及细胞间的相互作用有关，研究发现，EMP3基因在少突胶质瘤中过表达，除此之外，在原发性胶质母细胞瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、T细胞肿瘤中也均有EMP3差异表达的报道，因此，EMP3被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。但是，EMP3基因与肾纤维化之间的关系目前尚未见报道。

近年来，随着基因编辑技术的成熟，研究人员已经广泛将基因编辑技术应用于疾病相关基因的研究、疾病模型的建立和药物靶点的探索。现有的基因编辑技术以基于CRISPR系统的基因编辑为研究热点，目前最受关注的有3种：(1)CRISPR-Cas9：是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，在特定的位点切割双链DNA断裂，在没有模板的情况下发生非同源重组连接，造成基因发生移码突变，从而导致基因的表达受阻。(2)CRISPR-Cas12：也是一种核酸内切酶，在识别DNA序列时，形成半封闭的R-loop,只有当识别的是特定的目的片段时，才能形成封闭的R-loop，因而具有较cas9有更高的靶向性。(3)CRISPR-Cas13d：是一类RNA介导的靶向RNA切割系统，常用于RNA敲低、单碱基编辑等领域。其中，Cas9、Cas12等系统主要针对DNA，对基因的剪切是永久性的，可能影响正常组织中该基因的功能，并且对基因的敲低效率不高。相比之下，CRISPR-Cas13d主要通过切割RNA降低目的基因的表达，使得结果具有一定可恢复性，并且所编辑的蛋白分子量最小，更利于载体的转染。

不过，尽管目前已有采用CRISPR-Cas13d系统在CHO悬浮细胞中敲低AMPK、IGFBP4-1基因的报道，但针对EMP3基因的靶向性sgRNA设计以及抑制EMP3对慢性肾脏病肾纤维化等疾病发生发展的影响等还有待进一步研究探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制EMP3基因表达的CRISPR-Cas13d系统及EMP3抑制剂的用途。

本发明提供了一种靶向EMP3基因mRNA的sgRNA，序列如SEQ IDNO.1～4任一所示。

进一步地，上述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，它是表达上述的sgRNA的重组载体。

本发明还提供了一种CRISPR-Cas13d系统，它是A组中任一项和B组中任一项的组合，或是C组中任一项：

A组：sgRNA、表达sgRNA的质粒、表达sgRNA的病毒；

B组：Cas13d蛋白、表达Cas13d蛋白的质粒、表达Cas13d蛋白的病毒；

C组：表达sgRNA和Cas13d蛋白的重组质粒、表达sgRNA和Cas13d蛋白的重组病毒；