[发明专利]重组的转氨酶及其酶制剂和应用

说明书

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，特别是涉及生物催化不对称合成手性中间体的技术领域，更为具体的说是涉及重组的转氨酶及其酶制剂和应用。利用基因工程技术，通过转氨酶工程菌的重组和构建，成功获得了能够应用于(1R，2S)‑2‑(3,4_二氟苯基)环丙胺中手性胺制备的工程菌。通过这种方法制备替格瑞洛中间体化合物(1R，2S)‑2‑(3,4_二氟苯基)环丙胺具有高效、清洁的生产优势，是一种符合现代化绿色生产要求的工业生产方法。

技术领域

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，特别是涉及生物催化不对称合成手性中间体的技术领域，更为具体的说是涉及重组的转氨酶及其酶制剂和应用。

背景技术

转氨酶又称氨基转移酶，是一类磷酸吡哆醛依赖性的转移酶，在氨基供体存在下能够特异性地将氨基转移到底物酮上，得到相应的手性胺。作为一种绿色催化剂，转氨酶参与的转氨反应过程具有反应简单、绿色环保等优势。

转氨酶的催化活性与底物具有密切关系。通过对生物催化剂进行分子改造，提高天然酶在某种、某类合成中的催化性能，对于工业化酶法合成应用具有重要的意义。

替格瑞洛是一种由英国的阿斯利康公司所研发的新型的环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物，是一种选择性二磷酸腺苷受体拮抗剂，作用于P2Y12ADP受体来抑制ADP介导的血小板活化和聚集，该药于2012年11月获准在中国上市。

(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺是制备替格瑞洛的关键中间体。目前现有技术中已经公开了该中间体化合物的多种制备方案，但是通过酶法制备替格瑞洛的关键中间体(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的重组转氨酶工程菌，并获得能够应用在替格瑞洛的关键中间体(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺手性胺制备中，从而可以显著提高催化活性，高效制备获得目标化合物。

为了解决上述技术问题，本发明首先公开了重组转氨酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

进一步地，本发明还公开了所述重组转氨酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

同时，本发明还公开了一种重组菌株，所述重组菌种表达如SEQ ID NO：1所示的重组转氨酶。

进一步地，所述的重组菌株是以pET-30a质粒为表达载体表达重组转氨酶。

进一步地，所述的重组菌株是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞。

进一步地，所述重组菌株是将如SEQ ID NO：2所示的转氨酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中形成。

同时本发明还公开了包含有上述重组菌种发酵生产得到的转氨酶的酶制剂。

进一步地，本发明还公开了重组菌种发酵生产转氨酶的方法，具体步骤为，将转氨酶重组菌株种子液按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，即转氨酶发酵液。

最后，本发明还公开了利用前述重组菌种发酵生产转氨酶的方法获得的转氨酶在催化酮类化合物转氨反应制备手性胺中的应用，所述酮类化合物是指式II化合物或其类似化合物，

并且具体地，在本发明中还具体的公开了所述转氨酶在制备替格瑞洛手性中间体化合物的应用，合成工艺路线如下所示：