[发明专利]一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌满足自我复制的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；

所述重组质粒为以下之一：

(1)包含如SEQ ID NO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块；

(2)包含如SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；

(3)包含如SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和如SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块。

2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述恶臭假单胞菌的株型为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440 ATCC NO.4705。

3.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，对于(3)，所述对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入至两不同的重组质粒上，且两重组质粒均满足在恶臭假单胞菌中自我复制并相容。

4.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述重组质粒的原始表达载体为pSEVA64。

5.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌工程菌，其特征在于，所述乙二醇代谢的关键基因为gclR，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种如权利要求1～5任一项所述的恶臭假单胞菌工程菌的制备方法，其特征在于，包括：

(1)利用基因敲除技术将恶臭假单胞菌基因组影响乙二醇代谢的关键基因敲除，敲除后，进行实验室适应性进化，得到进化后的工程菌；

(2)将对苯二甲酸分解代谢模块插入至原始表达载体上；或者，将对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块分别插入至两原始表达载体上，得到重组质粒；

(3)将重组质粒转化至敲除基因后的工程菌中，得到恶臭假单胞菌工程菌。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述实验室适应性进化的方法包括如下步骤：

(A)挑取LB固体培养基中的恶臭假单胞菌单菌落，接种至液体LB培养基中进行培养，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养12-16h，得到种子液体培养物；

(B)将步骤(1)得到的种子液体培养物按照2v/v％的接种量接种在进化培养基中进行培养，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养至细胞OD达0.4～0.8，得第一代细胞培养物；

(C)将步骤(2)所得的第一代细胞培养物转接至新鲜进化培养基中，置于摇床上，在30℃条件下，以220r/min的转速培养至细胞OD达0.4～0.8，得到所述菌株的第二代细胞培养物；

(D)不断重复步骤(3)，得到第10～20代细胞培养物；

(E)当细胞生长周期稳定，停止传代，得到进化后的工程菌。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述进化培养基的配方为：1L蒸馏水中含：3.88g K₂HPO₄，2.12g NaH₂PO₄·2H₂O，2.00g(NH₄)₂SO₄，0.1gMgCl₂·6H₂O，10mg EDTA，2mgZnSO₄·7H₂O，1mg CaCl₂·2H₂O，5mg FeSO₄·7H₂O，0.2mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.2mg CuSO₄·5H₂O，0.4mg CoCl₂·6H₂O。

9.如权利要求1～5任一项所述的恶臭假单胞菌工程菌或权利要求6～8任一项所述的制备方法制得的恶臭假单胞菌工程菌在高效共利用乙二醇和对苯二甲酸中的应用。