[发明专利]一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用，该恶臭假单胞菌工程菌，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌的重组质粒；恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；重组质粒包含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；或SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块。本发明以恶臭假单胞菌为出发菌株，通过敲除影响乙二醇代谢的关键内源基因，并在此基础上外源导入对苯二甲酸代谢模块和对苯二甲酸转运模块，得到了恶臭假单胞菌工程菌；该恶臭假单胞菌工程菌可以高效共利用对苯二甲酸与乙二醇。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)聚合而成的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，是人类生活中最广泛使用的塑料之一。PET的不恰当回收会造成严重的环境问题，而生物法升级回收是近年来全球关注的热点问题。

PET的完全降解是从人工微生物联合体的模式开始发展的，即构建一个PET降解模块，一个EG转化模块和一个TPA转化模块来执行不同的功能，可以加速PET的降解，并实现其完全转化。然而微生物联合体需要较为复杂的混合模式，不利于实际应用。PET生物降解的瓶颈之一是利用同一株菌同时将TPA与EG高效分解代谢。

恶臭假单胞菌ATCC 47054(即Pseudomonas putida KT2440)是近年来引起学者广泛兴趣的一种新的合成生物学底盘，已被用于代谢难降解底物，包括木质素和石油基塑料等。但是，该菌株不能以对苯二甲酸为唯一碳源生长，极大地限制了其在PET生物降解领域的应用。

本发明旨在提出一种新型改造策略，赋予恶臭假单胞菌高效共利用对苯二甲酸与乙二醇的能力。

发明内容

本发明提供了一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用，该恶臭假单胞菌工程菌能够同时高效地利用乙二醇和对苯二甲酸，用于实现PET的高效生物降解。

具体技术方案如下：

一种恶臭假单胞菌工程菌，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基因；

所述重组质粒为以下之一：

(1)包含如SEQ ID NO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块；

(2)包含如SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；

(3)包含如SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块和如SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块。

其中，SEQ ID NO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块来源于阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)GO16(GenBank:CP044409.1)；SEQ ID NO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块是由来源于丛毛单胞菌(Comamonas sp.)E6的对苯二甲酸分解代谢模块(SEQID NO.4)中的转运蛋白模块(SEQ ID NO.5(protein_id＝BAE47084.1))替换成来源于阴城假单胞菌GO16的转运蛋白模块(SEQ ID NO.3)得来；SEQ ID NO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块来源于丛毛单胞菌(Comamonas sp.)E6(GenBank:AB238679.1)；SEQ ID NO.3所示的对苯二甲酸转运模块来源于阴城假单胞菌GO16(protein_id＝QFG29484.1)。上述菌株为已公开菌株，且对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块均可通过生物合成获得。

对苯二甲酸分解代谢模块，是由多个基因组成的对苯二甲酸分解代谢基因簇，包含了转录因子，转运蛋白，环羟基化1，2-双加氧酶和二氢二醇脱氢酶；对苯二甲酸转运模块为对苯二甲酸转运蛋白。