[发明专利]朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物、试剂盒及其应用和方法

说明书

本发明“朱顶红褪绿环斑病毒RT‑LAMP检测引物、试剂盒及其应用和方法”属于分子生物学技术领域。本发明的朱顶红褪绿环斑病毒RT‑LAMP检测引物组包括：序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV‑NP‑F3‑1和HCRV‑NP‑B3‑1；序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV‑NP‑FIP‑1和HCRV‑NP‑BIP‑1；序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV‑NP‑LF‑1和HCRV‑NP‑LB‑1。本发明的引物组检测HCRV的灵敏度是常规RT‑PCR的100倍。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物、试剂盒及其应用和方法。

背景技术

朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV)是2013年首次在中国云南昆明朱顶红上发现并报道的布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)新病毒。通过流行病学调查和寄主范围研究发现，HCRV的首要传播介体是细角带蓟马(Taeniothrips eucharii)^[5],目前该病毒已在云南、福建、广西、广东、海南等中国南部省份广泛扩散，对辣椒(Capsicumannuum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)等许多重要农作物和蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis)、喜林芋(Philodendron schott)、朱顶红(Hippeastrum rutilum)、君子兰(Clivia miniata)、一点红(Emilia sonchifolia)等园艺作物造成严重损害，被HCRV侵染后的植株典型症状为：叶片局部褪绿、坏死斑、同心环纹、叶片畸形等。HCRV短短几年增加了十几种寄主，扩散到云南、福建、广西等多个省份，传播速度极快，严重危害园林植物和农作物^[28]。HCRV易与其他Orthotospovirus病毒复合侵染，在寄主上的症状极为相似，仅凭肉眼难以判断。尚未培育出抗性品种，防治比较困难，危害潜力极大。

筛选无毒幼苗是预防HCRV大面积传播的主要方法之一，但寄主在病毒侵染早期并没有表现出明显的症状。目前检测HCRV的方法主要包括电子显微镜检测、血清学检测、DAS-ELISA检测、分子生物学RT-PCR检测。电子显微镜检测结果耗时长、操作繁琐，难以满足生产上快速、高效、准确检测病原的要求；ELISA检测需要制备高质量的病毒血清和特异性抗体，检测时间较长；PCR检测要求大量设备仪器,对实验操作要求严格，这些缺点大大限制了这些检测方法在实际生产中的推广应用，这些方法均不适用于实际生产。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本学者Notomi等人发明的针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，在恒温条件利用一种DNA链置换聚合酶(Bst DNA polymerase)即可扩增靶基因的重要检测技术，实验仪器仅需一个水浴锅，反应完成后，加入荧光染料可直接观察结果。它具有检测速度快，灵敏度高，不需要专业设备的优点，已被广泛应用于农业、临床医学、畜牧业、水产渔业、食品等各种领域检测。